LasI/rhlI基因缺失和阿奇霉素對銅綠假單胞菌毒力基因的影響

鄂順梅 陳富 龍一飛 林冬玲 蔡壬辛

廣州中醫藥大學第二附屬醫院檢驗醫學部（廣州 510006）

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是一種條件致病菌，臨床分離率較高，易造成長期反復感染［1］。群體感應系統（quorum sensing，QS）是廣泛存在于細菌群體中的依賴細菌密度的信號通訊系統，可調控細菌種群內各種毒力基因的表達，與細菌致病性和耐藥性密切相關［2］。PA有3個重要的QS系統：Las系統，Rhl系統和Pqs系統。LasI和rhlI基因分別編碼3?O?C12?HSL和 C4?HSL兩種酰基高絲氨酸內酯（acylhomoserine lactone，AHLs）信號分子，AHLs結合并激活各自的轉錄激活劑LasR和RhlR，最終調控多種毒力基因的表達［3］。Las系統主要調控外毒素A（exotoxin A）、LasA蛋白酶、堿性蛋白酶（alkaline protease）、外酶（exoen?zymes）和彈性蛋白酶（elastase）的合成；Rhl系統可調控鼠李糖脂（rhamnolipid）和磷脂酶（phospholi?pase）的合成［4-5］。Pqs系統是PA特有的QS系統，PQS信號分子與其受體PqsR結合后可活化pqs?ABCDE和phnAB操縱子的表達，產生更多的PQS信號分子和綠膿菌素［6］。多種毒力因子的釋放是PA感染難治性的主要原因，因此抑制QS系統從而調控毒力因子的釋放是目前治療PA感染的主要方向［7-8］。本研究擬通過lasI和rhlI基因的缺失，以及利用QS系統抑制劑阿奇霉素（azithromycin，AZM），觀察兩者對PA毒力基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑野生型PA菌株由美國羅切斯特大學Barbara H.Iglewski教授饋贈；LasI基因缺失的PA菌株（PA?ΔlasI）、RhlI基因缺失的PA菌株（PA?ΔrhlI）和兩者均缺失的PA菌株（PA?Δla?sIrhlI）由本實驗室構建；RNA提取試劑盒（Promega公司）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司）；熒光定量PCR試劑盒（Thermo Fisher公司）；阿奇霉素（廣東省藥品檢驗所）。

1.2 微量肉湯法測定阿奇霉素的MIC值參照CLSI M07?A9測定阿奇霉素的MIC值。將100μL倍比稀釋后的阿奇霉素藥液加入96孔板。挑取PA，PA?ΔlasI，PA?ΔrhlI和PA?ΔlasIrhlI單個菌落接種于3 mL LB培養基中，37℃恒溫搖床200 r/min培養至指數生長期。取10μL稀釋后的細菌培養物（5×104CFU/孔）接種于含有藥液的96孔板中，35℃孵育18～20 h，判讀結果。阿奇霉素對4種PA菌株的MIC值為128μg/mL，在本研究中，阿奇霉素處理所有菌株的濃度均為2μg/mL。

1.3 比濁法檢測PA的增殖曲線挑取PA，PA?Δla?sI，PA?Δrhl和PA?ΔlasIrhl單個菌落接種于3 mL LB培養基中，37℃恒溫搖床200 r/min培養過夜。取20μL培養物接種于3 mL LB培養基中，37℃振蕩培養，2μg/mL阿奇霉素處理上述培養物，培養2、4、6、8、10、12 h后收集并檢測A600吸光度值，繪制增殖曲線。實驗重復3次。

1.4 熒光定量PCR（qPCR）檢測毒力基因表達改變按照RNA試劑說明書提取PA菌株的總RNA，取1μg RNA經TaKaRa公司PrimeScript RT reagent試劑盒逆轉錄成cDNA；按照Thermo Fisher公司SYBR Green qPCR Master Mix熒光定量試劑盒說明書進行熒光定量PCR操作，所用引物見表1。采用rpoD基因作為內參基因，通過2?△△CT法對所有基因熒光定量PCR數據進行處理，計算出目的基因的相對表達量。

1.5 統計學方法所有實驗均進行3次重復。本研究采用SAS 9.2統計軟件進行方差分析，計算P值，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LasI/rhlI基因缺失及阿奇霉素對PA菌株增殖的影響如圖1所示，野生型PA以及突變體PA?ΔlasI，PA?ΔrhlI和PA?ΔlasIrhlI培養2、4、6、8、10、12 h后，上述4種PA菌株的增殖曲線沒有差異（P＞0.05），表明QS系統缺失對PA菌株的生長無顯著影響。此外，與無阿奇霉素處理的對照組相比，2μg/mL的阿奇霉素不影響PA菌株的生長（P＞0.05）（圖1）。

表1 熒光定量PCR引物列表Tab.1 List of primers for fluorescent quantitative PCR

圖1 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素處理后對PA增殖的影響Fig.1 Effect of LasI/rhlIdeletion and azithromycin on the proliferation of pseudomonas aeruginosa.

2.2 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素對Las系統相關基因表達的影響缺失lasI基因（ΔlasI，ΔlasI rhlI）后，lasI表達消失，其下游基因lasA及aprX的表達較野生型明顯降低（P＜0.01），而缺失rhlI則無此效應（圖2A、2B、2C）。阿奇霉素處理野生型PA后，lasI的表達水平較無阿奇霉素處理組明顯減低（P＜0.05）（圖2A），而Las系統下游毒力基因lasA/aprX表達則明顯升高，但缺失lasI或rhlI后，阿奇霉素對Las系統下游基因lasA/aprX的促進作用減弱甚至消失（圖2B、2C）。缺失lasI/rhlI及阿奇霉素處理后toxA的表達均無明顯改變（圖2D）。

2.3 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素對Rhl系統相關基因表達的影響無阿奇霉素處理組，缺失lasI（ΔlasI，ΔlasIrhlI）后，Rhl系統下游基因rhlA/rhlB的表達較野生型PA顯著降低（P＜0.01），但缺失rhlI后，二者的表達下調不顯著。阿奇霉素處理野生型PA后，rhlA/rhlB表達上調（P＜0.001），但缺失lasI或rhlI后，阿奇霉素對Rhl系統下游基因的促進作用消失（圖3）。

圖2 qPCR檢測lasI/rhlI基因缺失及阿奇霉素處理后Las系統相關基因mRNA的表達Fig.2 Fluorescence quantitative PCRwas used to detect the mRNA expression of Las system related genes after lasI/rhlIgene deletion and azithromycin treatment

圖3 qPCR檢測lasI/rhlI基因缺失及阿奇霉素處理后Rhl系統相關基因mRNA的表達Fig.3 Fluorescence quantitative PCRwas used to detect the mRNA expression of Rhl system related genes after lasI/rhlIgene deletion and azithromycin treatment

2.4 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素對PQS系統相關基因表達的影響缺失lasI后，phnA/B表達較野生型PA顯著下調（P＜0.05，P＜0.01），但缺失RhlI則無此效應。阿奇霉素處理野生型PA后，顯著促進phnA/B基因表達（P＜0.001），但缺失lasI后，阿奇霉素對phnA/B表達增強作用不顯著甚至消失（圖4）。

圖4 qPCR檢測lasI/rhlI基因缺失及阿奇霉素處理后PQS系統相關基因mRNA的表達Fig.4 Fluorescence quantitative PCR was used to detect the mRNA expression of PQSsystem related genes after lasI/rhlI gene deletion and azithromycin treatment

2.5 LasI/rhlI缺失及阿奇霉素對qscR表達的影響缺失lasI后，qscR表達輕微下調（P＜0.05）。阿奇霉素處理野生型PA后，qscR表達顯著上調（P＜0.001），但缺失lasI或rhlI后，阿奇霉素對qscR表達增強較野生型PA明顯減弱（圖5）。

3 討論

銅綠假單胞菌QS系統激活后可調節300多個毒力基因，這些基因廣泛參與：細菌生長、運動、鞭毛形成、生物被膜形成，以及參與細菌與宿主間的相互作用等關鍵致病環節［9-10］。銅綠假單胞菌QS系統與細菌致病和宿主逃避等行為密切相關，是臨床細菌抗感染研究的熱點問題，干擾銅綠假單胞菌的QS系統可有效調節細菌致病性和耐藥性。銅綠假單胞菌的QS系統存在級聯調節機制：Las系統位于調控網絡的頂層，受到刺激信號后最先被啟動，使lasI表達上調，同時該系統也可正向調控Rhl系統［11-12］。PQS信號分子的合成同時依賴Las系統的調控，Las系統是PQS的正向調節因子；同時PQS又可以調節rhlI的表達和某些依賴于Rhl系統的基因的表達，從而將這兩個系統聯系起來［13］。QscR（quorum?sensing control repressor）是近年來新發現一個孤兒受體，它不能合成特定的自誘導分子，但是可以通過結合3?O?C12?HSL，C4?HSL等信號分子，抑制Las和Rhl系統，QscR活性同時需要Las系統合成的AHL的調節［14］。

本文研究結果顯示，在PA生長早期（培養6 h），缺失lasI基因導致毒力相關基因lasA、aprX、rhlA、rhlB、phnA及phnB表達下調，而缺失rhlI基因對上述毒力基因的表達基本無影響，這可能由于Las系統正向調控RhlR，從而彌補了rhlI基因缺失對RhlR激活的缺失。而lasI/rhlI缺失及阿奇霉素處理后toxA的表達無明顯改變，可能由于toxA主要在細菌對數生長期末期產生有關［15］。而2μg/mL的阿奇霉素可抑制lasI的表達，但卻促進lasI下游毒力相關基因的表達，提示阿奇霉素可能通過不依賴于lasI的機制調控毒力基因表達。而在lasI缺失組，雖然毒力相關基因表達顯著下調，但阿奇霉素處理也能在一定程度上促進毒力相關基因的表達，但毒力相關基因總的表達水平比較弱。文中圖5結果顯示，缺失lasI后，qscR表達下調，推測與Las系統對qscR的表達有一定的正反饋作用有關；在野生型PA中，2μg/mL的阿奇霉素可上調qscR，qscR是Las與Rhl系統的抑制者，這可能是阿奇霉素抑制lasI表達的原因。以上結果提示：PA毒力基因的表達主要還是受QS系統調控；低濃度阿奇霉素可能繞過QS系統而促進毒力相關基因表達，但缺失QS系統仍然能顯著抑制阿奇霉素誘導的毒力基因表達。

隨著抗生素的廣泛使用，PA耐藥率逐年上升，給臨床治療帶來極大的困難，迫切需要尋找新的抗感染途徑。PA是革蘭陰性致病菌中QS系統研究的較深入的一種菌種，該ces系統在調節PA諸如毒力因子產生、生物膜形成等與細菌耐藥性密切相關的生理現象均起著重要的作用。通過深入研究QS系統，可望闡明細菌耐藥性和致病性的關系，解決目前與日俱增的細菌耐藥性問題。