血漿甲基化透明質(zhì)酸酶-2檢測(cè)對(duì)胰腺癌的診斷效能

郝一,張煦,李紅超 ,鮑美華

(1 長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙410219； 2蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3湖南省腫瘤醫(yī)院；4長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院)

胰腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，患者中位生存期3～6個(gè)月，五年生存率不足5%[1]。病理組織活檢是目前臨床胰腺癌的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，其他輔助診斷方式包括以糖類抗原CA19-9為主的血漿腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)檢查以及內(nèi)鏡等方法。癌胚抗原(CEA)是臨床常用的腫瘤相關(guān)抗原。CA19-9是應(yīng)用最廣泛和臨床價(jià)值最高的胰腺癌腫瘤標(biāo)志物，但其在胃腸道腫瘤、急慢性胰腺炎及肝硬化等非胰腺惡性腫瘤疾病中均能出現(xiàn)[2]。CT檢查是疑似胰腺腫瘤的首選影像學(xué)檢查，但胰腺癌早期缺乏特異性的影像學(xué)表現(xiàn)，影像學(xué)檢查在胰腺癌的早期診斷敏感性和特異性均不理想[3]。胰腺癌患者早期常缺乏明顯臨床癥狀，確診時(shí)只有15%～20%的患者可行手術(shù)治[4]。晏冬等[5]關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化對(duì)胰腺癌的診斷尤其是其早期診斷，具有重要價(jià)值。透明質(zhì)酸酶-2(HYAL2)是一種抑癌因子，可降解透明質(zhì)酸，參與細(xì)胞黏附、 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞遷移、血管生成和新陳代謝等過程。目前關(guān)于甲基化HYAL2水平在胰腺癌診斷中的應(yīng)用情況相關(guān)報(bào)道較少。本研究觀察了64例胰腺癌患者外周血甲基化HYAL2水平，探討外周血甲基化HYAL2水平對(duì)胰腺癌的診斷效能。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2017年12月間我院收治的疑似胰腺癌患者125例，其中男66例、女59例，年齡41～65(52.42±11.35)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往胰腺癌相關(guān)放化療者；②合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤者；③合并嚴(yán)重的心、肝、肺等其他臟器病變者。125例患者均行手術(shù)切除胰腺組織并行病理學(xué)檢查。經(jīng)組織病理學(xué)檢查分為胰腺癌組64例(觀察組)，其中男34例、女30例，年齡42～64(51.89±11.62)歲；均為胰腺導(dǎo)管腺癌，根據(jù)UICC第六版胰腺癌TNM分期Ⅰ期26例、Ⅱ期38例，血紅蛋白含量(Hb)(11.23±3.21)g/dL，白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)(8.01±5.34)×103/L，血小板計(jì)數(shù)(PLT)(105.32±70.12)×103/L，尿素(BUN)(4.72±3.34)mmol/L，堿性磷酸酶(ALP)(80.79±21.64)U/L，血漿淀粉酶(AMS)(190.52±171.12)U/L，脂肪酶(LPS)(341.56±83.61)U/L，總膽紅素(TBil)(20.32±1.29)μmol/L，直接膽紅素(DBil)(7.42±1.96)μmol/L。觀察組術(shù)后病理可見實(shí)性腫物，邊界不清，質(zhì)硬，灰白或灰黃色，彌漫浸潤(rùn)胰腺實(shí)質(zhì)，受累的導(dǎo)管或小導(dǎo)管常擴(kuò)張。部分組織出現(xiàn)實(shí)性癌巢，腺管不規(guī)則，癌細(xì)胞核極向消失，可見細(xì)胞異型性。胰腺良性疾病患者61例(對(duì)照組)，其中男32例、女29例，年齡40～66(53.12±13.85)歲；其中慢性胰腺炎38例、胰腺囊腫15例、胰腺假性囊腫8例，Hb(12.16±2.08)g/dL，WBC(9.27±5.47)×103/L，PLT(107.32±73.23)×103/L，BUN(4.43±3.11)mmol/L，ALP(83.32±24.01)U/L，AMS(658.12±67.43)U/L，LPS(632.34±52.98)U/L，TBil(16.54±1.39)μmol/L，DBil(6.56±1.78)μmol/L。慢性胰腺炎患者術(shù)后病理可見腺泡組織呈不同程度萎縮，間質(zhì)彌漫性纖維組織增生和淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)管輕度擴(kuò)張。兩組年齡、Hb、WBC、PLT、BUN、ALP、TBil、DBil等指標(biāo)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。對(duì)照組血漿AMS、LPS水平高于觀察組(P均<0.05)。所有患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血漿甲基化HYAL2檢測(cè)方法 取兩組空腹靜脈血，2 500 r/min離心，分離血漿，-30 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ锛疤结樣缮虾Ｉど锕こ逃邢薰据o助設(shè)計(jì)及合成；2×TAG PCR MIX為北京歐比特有限公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器為L(zhǎng)ife Technologies公司產(chǎn)品。

應(yīng)用DNA提取試劑盒提取血漿DNA并用Alpha-1900紫外分光光度儀測(cè)定DNA濃度及純度；取1 μg提純DNA按照操作說明書進(jìn)行進(jìn)行亞硫酸氫鹽化修飾；2 μL修飾后DNA進(jìn)行MSP；Meth Premier5.0軟件設(shè)計(jì)甲基化特異引物、非甲基化特異引物序列見表1；PCR反應(yīng)總體系為25 μL，PCR buffer 2.5 μL， 2 μL dNTP mixture 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Tap酶0.125 μL，修飾后DNA模板4 μL。 PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；取5 μL部分?jǐn)U增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，另取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物送威斯騰生物有限公司用MethyLight定量PCR方法進(jìn)行甲基化HYAL2水平定量檢測(cè),使用甲基化百分比參數(shù)(PMR)來描述甲基化HYAL2。

表1 HYAL-2甲基化/非甲基化特異引物序列

2 結(jié)果

觀察組、對(duì)照組分別有2、13例擴(kuò)增出甲基化HYAL2陽(yáng)性片段，片段長(zhǎng)度111 bp。觀察組、對(duì)照組甲基化HYAL2檢出率分別為20.3% (13/64)、3.3%(2/61)，二者比較，P<0.05。觀察組、對(duì)照組血漿甲基化HYAL2的PMR分別為26.12%±10.11%、46.54%±18.86%，二者比較，P<0.05。

觀察組、對(duì)照組血漿CEA分別為(23.02±11.96)、(13.17±7.84)ng/mL，二者比較，P<0.05；觀察組、對(duì)照組血漿CA19-9分別為(215.39±38.05)、(26.40±20.31)U/mL二者比較，P<0.05。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血漿CA19-9、CEA及甲基化HYAL2是胰腺癌的影響因素。見表2。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胰腺癌患者血漿甲基化HYAL2水平與血漿CEA、CA19-9均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.755，-0.512；P均<0.05)。

表2 血漿AMS、LPS、CA19-9、CEA及甲基化HYAL2水平對(duì)胰腺癌診斷的多因素回歸分析結(jié)果

血漿甲基化HYAL2診斷胰腺癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.804，最佳診斷點(diǎn)34.435%，其敏感度為73.8%，特異度為85.3%；血漿CEA診斷胰腺癌的AUC為0.597，最佳診斷點(diǎn)為16.97 ng/mL，其敏感度為51.6%，特異性為68.9%；血漿CA19-9診斷胰腺癌的AUC為0.775，最佳診斷點(diǎn)為162.49 U/mL，其敏感度為75.0%，特異性為79.2%；因血漿CA19-9的AUC高于血漿CEA，故做血漿甲基化HYAL2與血漿CA19-9聯(lián)合診斷胰腺癌的診斷效能。血漿甲基化HYAL2與血漿CA19-9聯(lián)合診斷胰腺癌的AUC為0.873。

3 討論

胰腺癌是一種病死率非常高的惡性腫瘤，是世界第七大癌癥致死的病因[6]。如果對(duì)腫瘤直徑<1 cm的胰腺癌患者行手術(shù)為主的綜合治療，則5年生存率可接近100%。所以，發(fā)現(xiàn)胰腺癌的早期檢測(cè)方法迫在眉睫。而周原等[7]研究表明，DNA甲基化對(duì)胰腺癌的早期具有潛在的臨床價(jià)值，具有比傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物更高的靈敏度和特異度。

HYAL2是一種抑癌因子，作為一種降解透明質(zhì)酸的酶，參與細(xì)胞黏附、 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、癌癥演進(jìn)、血管生成和新陳代謝等過程。HYLA2基因低甲基化可能導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)或沉默，最終導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。Xiao 等[8]研究表明，隨著檢驗(yàn)技術(shù)的提高，外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA甲基化的檢測(cè)靈敏度有很大提升，有望成為胰腺癌早期篩查，無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方法；并且，DNA甲基化作為一種核酸類的腫瘤標(biāo)記物，在胰腺癌的診斷方面具有傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物所沒有的優(yōu)勢(shì),比如容易被檢測(cè)到、經(jīng)濟(jì)成本低以及早期即可出現(xiàn)等特點(diǎn)[9, 10]。

胰腺癌的病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，早期無(wú)明顯特異性癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已至進(jìn)展期，出現(xiàn)人體多個(gè)器官的損害，進(jìn)而導(dǎo)致肝腎功能等多項(xiàng)指標(biāo)的改變[11]。本研究中，將胰腺癌患者的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目比如血常規(guī)和較為特異性的腫瘤標(biāo)志物CA19-9，以及新指標(biāo)HYLA甲基化納入單因素及多因素Logistic回歸分析。單因素分析發(fā)現(xiàn)對(duì)照組患者AMS、LPS和血漿甲基化HYLA2水平大于觀察組組；觀察組患者血漿CA19-9、CEA均高于對(duì)照組。提示上述指標(biāo)與胰腺癌的發(fā)生有密切聯(lián)系。經(jīng)多因素分析顯示血漿CEA、CAA19-9以及血漿甲基化HYLA水平是胰腺癌的獨(dú)立影響因素，根據(jù)OR值對(duì)從胰腺疾病中鑒別胰腺癌的影響力依次為：血漿甲基化HYAL2、血漿CA19-9、CEA，且血漿CA19-9較CEA稍準(zhǔn)確。這與Chang 等[12]關(guān)于胰腺癌早期診斷的研究一致。

將甲基化HYLA2的PMR值分別與血漿CEA、CA19-9進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)PMR值與兩者均呈負(fù)相關(guān)，說明隨著血漿CEA、CA19-9增高，甲基化HYAL2水平呈下降趨勢(shì)，進(jìn)而提示血漿低甲基化的HYLA2水平與胰腺癌的發(fā)生具有密切關(guān)系，同傳統(tǒng)指標(biāo)一樣，對(duì)胰腺癌的診斷具有一定臨床價(jià)值。血漿甲基化HYLA2與血漿CA19-9聯(lián)合診斷的AUC最大，其次是血漿甲基化HYLA2，CEA的AUC最小。并且血漿甲基化HYLA2單獨(dú)診斷胰腺癌的特異度較高，敏感度稍低，提示血漿甲基化HYAL2診斷胰腺癌的潛在臨床價(jià)值可能優(yōu)于常規(guī)指標(biāo)，且血漿甲基化HYAL2與血漿CA19-9聯(lián)合診斷，能夠進(jìn)一步提升其診斷效能，有望成為胰腺癌患者篩查的可靠指標(biāo)。

然而，本實(shí)驗(yàn)只檢測(cè)了血漿樣本的甲基化HYLA2，并未對(duì)外周血各樣本中HYLA2進(jìn)行研究和分析，也未與胰腺組織、胰液等其他樣本進(jìn)行對(duì)照研究，因此可能低估了血漿甲基化HYLA2對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值。因此，仍需前瞻性研究和大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，以明確血漿甲基化HYLA2對(duì)胰腺癌早期的診斷價(jià)值。

綜上所述， 胰腺癌患者血漿甲基化HYAL2發(fā)生率較高。血漿甲基化HYAL2診斷胰腺癌的靈敏度、特異度均較高。血漿甲基化HYAL2聯(lián)合CA199檢測(cè)有助于胰腺癌的診斷。