高效液相色譜法檢測(cè)活性食品包裝薄膜中的香芹酚和百里香酚

楊春香，王易芬，王 婧*，李 立，文藝樺，楊秉浩

香芹酚（carvacrol，Cal）和百里香酚（thymol，Tml）是2種同分異構(gòu)體的單萜酚類(lèi)物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗菌譜。Cal及Tml普遍存在于唇形科植物及植物的精油中，如牛至精油、百里香揮發(fā)油和香薄荷屬等[1-2]。研究表明，Cal和Tml具有較強(qiáng)的生物活性，如抗氧化、抗菌等特性，可被用作食品添加劑、防腐劑等[3-7]。和食品添加劑加入到食物中相比，通過(guò)直接或間接的方式將抗菌抗氧化活性物質(zhì)與聚合物材質(zhì)進(jìn)行熔融共混，制備出的活性包裝薄膜不僅可以延長(zhǎng)食品的貨架期[8-9]，同時(shí)也保證了消費(fèi)者的飲食安全，并限制了因加入添加劑而造成食物不良風(fēng)味的產(chǎn)生[10]。目前，關(guān)于聚合材質(zhì)如聚丙烯、聚乙烯和乙烯-乙烯醇共聚物中添加植物精油的有效性及抗菌活性的研究越來(lái)越多[11-14]。Persico等[8]以有機(jī)改性的蒙脫土作為填充劑，Cal為活性物質(zhì)與低密度聚乙烯樹(shù)脂基材（low density polyethylene，LDPE）進(jìn)行共混改性制備出抗菌納米包裝薄膜，研究了改性LDPE薄膜的物理機(jī)械性能和抗菌性能。但該工作沒(méi)有對(duì)其抗菌的主要方式——活性物質(zhì)的遷移進(jìn)行研究。

由于全球環(huán)境問(wèn)題的日趨嚴(yán)峻，研究者們開(kāi)始將食品包裝的重心逐漸轉(zhuǎn)移到可生物降解的塑料材料和綠色包裝上來(lái)[15-18]。聚乳酸（polylactic acid，PLA）是以乳酸為主要原料聚合得到的聚合物，原料來(lái)源充分且可再生，且生產(chǎn)過(guò)程無(wú)污染，并通過(guò)生物降解實(shí)現(xiàn)在自然界中的循環(huán)，是理想的綠色高分子材料[19-22]。本實(shí)驗(yàn)以丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物（poly(butylene succinate adipate)，PBSA）為改性劑[23-25]，Cal和Tml為活性物質(zhì)加入到PLA基材中，通過(guò)熔融共混，流延制備出改性PLA食品活性包裝薄膜。該薄膜具有一定的抗菌抗氧化性能，可延長(zhǎng)食品的貨架壽命。其作用機(jī)理主要是通過(guò)薄膜中活性物質(zhì)擴(kuò)散到包裝袋的內(nèi)環(huán)境中，或遷移到經(jīng)包裝的食品表面來(lái)抑制微生物的滋生及脂質(zhì)的氧化腐敗[26]，最終保證食品的品質(zhì)并達(dá)到延長(zhǎng)保質(zhì)期的目的。

目前有關(guān)檢測(cè)食品包裝薄膜中Cal和Tml的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)尚未推出。此外，關(guān)于食品包裝薄膜及薄膜中活性成分的化學(xué)分析文獻(xiàn)和遷移檢測(cè)方法文獻(xiàn)也比較缺乏。楊希國(guó)[27]、吉力[28]等分別建立了高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定飼料、香薷中Cal和Tml的含量；董茂峰等[29]采用氣相色譜法測(cè)定飼料中Cal和Tml的含量，但檢測(cè)食品包裝薄膜中活性成分Cal和Tml的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。為探討食品包裝薄膜中活性物質(zhì)的遷移機(jī)理及遷移規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)建立基于HPLC法測(cè)定改性PLA包裝薄膜中Cal和Tml含量的方法。HPLC法測(cè)定薄膜中活性物質(zhì)的含量，具有操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、精確度高等優(yōu)點(diǎn)，不僅為食品包裝薄膜中Cal、Tml和相關(guān)酚類(lèi)的遷移檢測(cè)及應(yīng)用提供了依據(jù)，并為進(jìn)一步研究同類(lèi)型活性包裝薄膜的遷移規(guī)律及包裝食品的保鮮效果提供有效的分析檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PLA 東莞市粵發(fā)塑膠原料有限公司；PBSA昭和電工株式會(huì)社；Cal（純度99%）、Tml（純度98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；乙酸、無(wú)水乙醇（均為分析純），乙腈（HPLC級(jí)） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XSS-300轉(zhuǎn)矩流變儀、LSSL-20雙螺桿擠出機(jī)、LYJ-流延機(jī)裝置 上海科創(chuàng)橡塑機(jī)械設(shè)備有限公司；1260型HPLC儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品薄膜的制備

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制備出2 種不同的樣品薄膜：空白樣品：PLA＋PBSA；樣品：PLA＋PBSA＋質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% Cal＋質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% Tml。

薄膜樣品制備流程：PLA樹(shù)脂＋PBSA樹(shù)脂＋活性物質(zhì)→雙螺桿擠出、共混改性造粒→改性母粒→流延機(jī)流延膜→改性PLA活性包裝薄膜。樣品薄膜制備完后，裝入鋁箔自封袋內(nèi)并做好編號(hào)標(biāo)記，密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品檢測(cè)液的制備

參照Lopez等[30]的方法，將樣品薄膜浸泡于四類(lèi)食品模擬液中，檢測(cè)Cal和Tml的遷移率。純水模擬含水較多的食品、3%乙酸溶液模擬酸性食品、10%乙醇溶液模擬含酒精的食品、95%乙醇溶液模擬脂類(lèi)食品。同時(shí)測(cè)定樣品薄膜浸泡于流動(dòng)相溶液中時(shí)Cal和Tml的遷移率。

樣品薄膜按6 dm2/L（約1.00 g）裁剪碎后分別置于250 mL錐形瓶，鋁箔覆蓋避光。

1.3.3 樣品檢測(cè)液的提取

樣品薄膜在浸泡24 h和浸泡96 h后分別取樣，取樣前振蕩搖勻錐形瓶，取樣時(shí)，用相應(yīng)模擬液溶液3 倍稀釋?zhuān)崛∫航?jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾至樣品瓶，貯存于4 ℃冰箱內(nèi)，待檢測(cè)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取Cal和Tml標(biāo)準(zhǔn)品各0.050 0 g，分別置于50 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ＥR用時(shí)，用乙腈稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Sunfire C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（3∶2，V/V）；色譜柱溫（30±5）℃；流速1 mL/min；等梯度洗脫；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm；分析時(shí)間10 min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限測(cè)定結(jié)果

表1 Cal和Tml的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equations, limits of detection and limits of quantification for Cal and Tml

圖1 20 mg/L Cal和Tml標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatogram of mixture of 20 mg/L Cal and Tml standard

將配制的5、10、20、50、100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，在1.3.5節(jié)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定及回歸分析。由表1、圖1可知，在5～100 mg/L的范圍內(nèi)，Cal和Tml的線性關(guān)系良好。

2.2 樣品薄膜加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 平均回收率與RSD（n=6）Table 2 Recoveries of spiked samples and relative standard deviations(RSD) (n = 6)

將空白樣品薄膜按6 dm2/L（約1.00 g）浸泡于4 種食品模擬液及流動(dòng)相溶液中，分別向浸泡液中添加不同質(zhì)量濃度的Cal和Tml標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)[31]。由表2可知，在低、中、高的添加水平范圍內(nèi)，Cal平均回收率為71.6%～93.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為5.2%～8.3%，Tml平均回收率為73.1%～103.6%，RSD為5.0%～8.8%。由表2可知，Cal和Tml標(biāo)準(zhǔn)品在水、3%乙酸溶液及10%乙醇溶液中的加標(biāo)回收效果不佳，在95%乙醇溶液和乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中的回收效果相接近，這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)色譜檢測(cè)條件較佳。因此，分析實(shí)際樣品時(shí)選用乙腈-水（3∶2，V/V）溶液進(jìn)行模擬遷移。

2.3 自制活性薄膜樣品的檢測(cè)結(jié)果

表3 薄膜中活性物質(zhì)檢出回收率Table 3 Migration rates of Cal and Tml from films

圖2 乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中Cal和Tml的色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of Cal and Tml with mobile phase consisting of acetonitrile and water (3:2, V/V)

由表3可知，改性PLA活性包裝薄膜中的活性物質(zhì)在乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中浸泡24 h，96 h后的檢出回收率差異不大；薄膜浸泡24 h后，活性物質(zhì)幾乎完全溶出，且Cal的檢出回收率達(dá)95%，Tml的檢出回收率達(dá)97.5%；浸泡96 h后，Cal和Tml的檢出回收率均達(dá)97.5%。這表明添加有質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% Cal＋4% Tml的改性PLA活性包裝薄膜浸泡于模擬液在早期階段便可較好地遷移出活性物質(zhì)Cal和Tml。同時(shí)，在95%乙醇溶液和乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中的回收效果相接近，而95%乙醇溶液通常被用來(lái)模擬脂類(lèi)食品，因此該薄膜可能更適用于包裝脂類(lèi)含量較高的食品。圖2顯示，薄膜在乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中遷移出的Cal和Tml出峰情況較佳，峰強(qiáng)度高，定量精確度高。這表明實(shí)驗(yàn)選用的HPLC檢測(cè)條件較佳，可有效洗脫出樣品。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC測(cè)定改性PLA活性包裝薄膜中活性物質(zhì)Cal和Tml含量的方法。目前活性包裝薄膜中物質(zhì)遷移的相關(guān)檢測(cè)方法較少，主要原因是活性包裝薄膜制備工藝較復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)使用的樣品薄膜均為自制。本方法最終選用乙腈-水（3∶2，V/V）溶液為提取液，浸泡96 h后，薄膜中Cal和Tml的檢出回收率均達(dá)97.5%。

本方法具有操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、精確度高等優(yōu)點(diǎn)，不僅為食品包裝薄膜中Cal、Tml和相關(guān)酚類(lèi)的遷移檢測(cè)及應(yīng)用提供了依據(jù)，并為進(jìn)一步研究同類(lèi)型活性包裝薄膜的遷移規(guī)律及包裝食品的保鮮效果提供有效的分析檢測(cè)方法。