高效液相色譜法檢測活性食品包裝薄膜中的香芹酚和百里香酚

楊春香，王易芬，王 婧*，李 立，文藝樺，楊秉浩

香芹酚（carvacrol，Cal）和百里香酚（thymol，Tml）是2種同分異構(gòu)體的單萜酚類物質(zhì)，具有較強的抗菌譜。Cal及Tml普遍存在于唇形科植物及植物的精油中，如牛至精油、百里香揮發(fā)油和香薄荷屬等[1-2]。研究表明，Cal和Tml具有較強的生物活性，如抗氧化、抗菌等特性，可被用作食品添加劑、防腐劑等[3-7]。和食品添加劑加入到食物中相比，通過直接或間接的方式將抗菌抗氧化活性物質(zhì)與聚合物材質(zhì)進行熔融共混，制備出的活性包裝薄膜不僅可以延長食品的貨架期[8-9]，同時也保證了消費者的飲食安全，并限制了因加入添加劑而造成食物不良風味的產(chǎn)生[10]。目前，關(guān)于聚合材質(zhì)如聚丙烯、聚乙烯和乙烯-乙烯醇共聚物中添加植物精油的有效性及抗菌活性的研究越來越多[11-14]。Persico等[8]以有機改性的蒙脫土作為填充劑，Cal為活性物質(zhì)與低密度聚乙烯樹脂基材（low density polyethylene，LDPE）進行共混改性制備出抗菌納米包裝薄膜，研究了改性LDPE薄膜的物理機械性能和抗菌性能。但該工作沒有對其抗菌的主要方式——活性物質(zhì)的遷移進行研究。

由于全球環(huán)境問題的日趨嚴峻，研究者們開始將食品包裝的重心逐漸轉(zhuǎn)移到可生物降解的塑料材料和綠色包裝上來[15-18]。聚乳酸（polylactic acid，PLA）是以乳酸為主要原料聚合得到的聚合物，原料來源充分且可再生，且生產(chǎn)過程無污染，并通過生物降解實現(xiàn)在自然界中的循環(huán)，是理想的綠色高分子材料[19-22]。本實驗以丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物（poly(butylene succinate adipate)，PBSA）為改性劑[23-25]，Cal和Tml為活性物質(zhì)加入到PLA基材中，通過熔融共混，流延制備出改性PLA食品活性包裝薄膜。該薄膜具有一定的抗菌抗氧化性能，可延長食品的貨架壽命。其作用機理主要是通過薄膜中活性物質(zhì)擴散到包裝袋的內(nèi)環(huán)境中，或遷移到經(jīng)包裝的食品表面來抑制微生物的滋生及脂質(zhì)的氧化腐敗[26]，最終保證食品的品質(zhì)并達到延長保質(zhì)期的目的。

目前有關(guān)檢測食品包裝薄膜中Cal和Tml的國家標準、行業(yè)標準尚未推出。此外，關(guān)于食品包裝薄膜及薄膜中活性成分的化學分析文獻和遷移檢測方法文獻也比較缺乏。楊希國[27]、吉力[28]等分別建立了高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定飼料、香薷中Cal和Tml的含量；董茂峰等[29]采用氣相色譜法測定飼料中Cal和Tml的含量，但檢測食品包裝薄膜中活性成分Cal和Tml的方法鮮見報道。為探討食品包裝薄膜中活性物質(zhì)的遷移機理及遷移規(guī)律，本實驗建立基于HPLC法測定改性PLA包裝薄膜中Cal和Tml含量的方法。HPLC法測定薄膜中活性物質(zhì)的含量，具有操作簡單、分析時間短、精確度高等優(yōu)點，不僅為食品包裝薄膜中Cal、Tml和相關(guān)酚類的遷移檢測及應(yīng)用提供了依據(jù)，并為進一步研究同類型活性包裝薄膜的遷移規(guī)律及包裝食品的保鮮效果提供有效的分析檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PLA 東莞市粵發(fā)塑膠原料有限公司；PBSA昭和電工株式會社；Cal（純度99%）、Tml（純度98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實驗用水為Milli-Q超純水；乙酸、無水乙醇（均為分析純），乙腈（HPLC級） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XSS-300轉(zhuǎn)矩流變儀、LSSL-20雙螺桿擠出機、LYJ-流延機裝置 上?？苿?chuàng)橡塑機械設(shè)備有限公司；1260型HPLC儀 安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品薄膜的制備

實驗設(shè)計制備出2 種不同的樣品薄膜：空白樣品：PLA＋PBSA；樣品：PLA＋PBSA＋質(zhì)量分數(shù)4% Cal＋質(zhì)量分數(shù)4% Tml。

薄膜樣品制備流程：PLA樹脂＋PBSA樹脂＋活性物質(zhì)→雙螺桿擠出、共混改性造?！男阅噶！餮訖C流延膜→改性PLA活性包裝薄膜。樣品薄膜制備完后，裝入鋁箔自封袋內(nèi)并做好編號標記，密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品檢測液的制備

參照Lopez等[30]的方法，將樣品薄膜浸泡于四類食品模擬液中，檢測Cal和Tml的遷移率。純水模擬含水較多的食品、3%乙酸溶液模擬酸性食品、10%乙醇溶液模擬含酒精的食品、95%乙醇溶液模擬脂類食品。同時測定樣品薄膜浸泡于流動相溶液中時Cal和Tml的遷移率。

樣品薄膜按6 dm2/L（約1.00 g）裁剪碎后分別置于250 mL錐形瓶，鋁箔覆蓋避光。

1.3.3 樣品檢測液的提取

樣品薄膜在浸泡24 h和浸泡96 h后分別取樣，取樣前振蕩搖勻錐形瓶，取樣時，用相應(yīng)模擬液溶液3 倍稀釋，提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶，貯存于4 ℃冰箱內(nèi)，待檢測。

1.3.4 標準溶液的配制

準確稱取Cal和Tml標準品各0.050 0 g，分別置于50 mL棕色容量瓶中，乙腈定容，配制成1 000 mg/L的標準儲備溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。臨用時，用乙腈稀釋上述標準儲備溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的標準工作液。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Sunfire C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相：乙腈-水（3∶2，V/V）；色譜柱溫（30±5）℃；流速1 mL/min；等梯度洗脫；進樣量10 μL；檢測波長274 nm；分析時間10 min；檢測器為紫外檢測器。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限測定結(jié)果

表1 Cal和Tml的標準曲線方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equations, limits of detection and limits of quantification for Cal and Tml

圖1 20 mg/L Cal和Tml標準品的HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatogram of mixture of 20 mg/L Cal and Tml standard

將配制的5、10、20、50、100 mg/L標準工作液，在1.3.5節(jié)色譜條件下進行測定及回歸分析。由表1、圖1可知，在5～100 mg/L的范圍內(nèi)，Cal和Tml的線性關(guān)系良好。

2.2 樣品薄膜加標回收率實驗結(jié)果

表2 平均回收率與RSD（n=6）Table 2 Recoveries of spiked samples and relative standard deviations(RSD) (n = 6)

將空白樣品薄膜按6 dm2/L（約1.00 g）浸泡于4 種食品模擬液及流動相溶液中，分別向浸泡液中添加不同質(zhì)量濃度的Cal和Tml標準溶液，進行加標回收實驗[31]。由表2可知，在低、中、高的添加水平范圍內(nèi)，Cal平均回收率為71.6%～93.7%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為5.2%～8.3%，Tml平均回收率為73.1%～103.6%，RSD為5.0%～8.8%。由表2可知，Cal和Tml標準品在水、3%乙酸溶液及10%乙醇溶液中的加標回收效果不佳，在95%乙醇溶液和乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中的回收效果相接近，這說明本實驗色譜檢測條件較佳。因此，分析實際樣品時選用乙腈-水（3∶2，V/V）溶液進行模擬遷移。

2.3 自制活性薄膜樣品的檢測結(jié)果

表3 薄膜中活性物質(zhì)檢出回收率Table 3 Migration rates of Cal and Tml from films

圖2 乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中Cal和Tml的色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of Cal and Tml with mobile phase consisting of acetonitrile and water (3:2, V/V)

由表3可知，改性PLA活性包裝薄膜中的活性物質(zhì)在乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中浸泡24 h，96 h后的檢出回收率差異不大；薄膜浸泡24 h后，活性物質(zhì)幾乎完全溶出，且Cal的檢出回收率達95%，Tml的檢出回收率達97.5%；浸泡96 h后，Cal和Tml的檢出回收率均達97.5%。這表明添加有質(zhì)量分數(shù)4% Cal＋4% Tml的改性PLA活性包裝薄膜浸泡于模擬液在早期階段便可較好地遷移出活性物質(zhì)Cal和Tml。同時，在95%乙醇溶液和乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中的回收效果相接近，而95%乙醇溶液通常被用來模擬脂類食品，因此該薄膜可能更適用于包裝脂類含量較高的食品。圖2顯示，薄膜在乙腈-水（3∶2，V/V）溶液中遷移出的Cal和Tml出峰情況較佳，峰強度高，定量精確度高。這表明實驗選用的HPLC檢測條件較佳，可有效洗脫出樣品。

3 結(jié) 論

本實驗建立HPLC測定改性PLA活性包裝薄膜中活性物質(zhì)Cal和Tml含量的方法。目前活性包裝薄膜中物質(zhì)遷移的相關(guān)檢測方法較少，主要原因是活性包裝薄膜制備工藝較復(fù)雜，本實驗使用的樣品薄膜均為自制。本方法最終選用乙腈-水（3∶2，V/V）溶液為提取液，浸泡96 h后，薄膜中Cal和Tml的檢出回收率均達97.5%。

本方法具有操作簡單、分析時間短、精確度高等優(yōu)點，不僅為食品包裝薄膜中Cal、Tml和相關(guān)酚類的遷移檢測及應(yīng)用提供了依據(jù)，并為進一步研究同類型活性包裝薄膜的遷移規(guī)律及包裝食品的保鮮效果提供有效的分析檢測方法。