生菜對鎘脅迫的生理響應及體內鎘的累積分布

賈月慧，韓瑩琰，劉 杰，高 凡，梁 瓊，俞 萍，劉超杰，張 鑫，蘇博偉

（北京農學院植物科學技術學院/農業應用新技術北京市重點實驗室，北京 102206）

鎘是一種累積性的劇毒元素，進入土壤后很容易被植物吸收，導致體內代謝發生紊亂[1]。其對植物的毒害機理可能是：（1）束縛自由巰基使蛋白變性或失活；（2）置換不同蛋白，包括轉錄因子和酶的輔因子；（3）產生活性氧[2]。鎘一旦經皮層組織在根部積累到一定程度，將損害根尖細胞，抑制其多種酶的活性，降低營養元素的吸收和轉運，干擾正常代謝，使根系生長速率下降[3]。植物從土壤中吸收鎘后，大部分富集在根部，遷移到地上部分的較少。一般而言，植物體內鎘的分布具有以下規律：根＞莖＞葉＞子實[2]。當鎘轉運到植物各個部位，并積累到一定數量（或濃度）后將引起毒害，如脂質過氧化，產生大量丙二醛（MDA）[2]。然而，植物通過調節如過氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等一系列保護酶的活性來響應外界脅迫。低濃度鎘將增強酶系統的活性，降低對植物生理毒害，對植物各代謝有一定促進作用[4]，但鎘繼續累積，則酶活性被抑制，進一步干擾葉片氣孔的開閉合，降低其電導率、減少CO2的吸收，抑制蒸騰作用，葉片失綠，損壞光合系統，最終導致光合效率下降，影響作物的產量與品質[2，4]。

根據《全國土壤污染狀況調查公報》的數據，鎘點污染超標率最高[5]。陳同斌課題組[1]2006年對北京市蔬菜及菜地土壤鎘含量的大規模調查發現：菜地土壤鎘累積明顯（0.091～0.971 mg·kg-1），其中兩個樣點鎘含量（0.971 mg·kg-1和0.886 mg·kg-1）超過《土壤環境質量標準》（GB 15618—1995）中的二級標準；蔬菜鎘含量在0.1～101.412 μg·kg-1，其對北京市部分人群存在一定的潛在健康風險。生菜（Lactuca sativa L.）作為鮮食綠葉蔬菜，鮮嫩口感好、熱量低，備受消費者青睞，因此在全國各地被廣泛種植[6]。但生菜對鎘脅迫的研究相對較少，結論也存在差異。田丹等[7]研究表明，隨著鎘濃度的升高，生菜種子發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數均表現為不同程度的降低；而徐劼等[8]研究表明，低濃度鎘脅迫對生菜種子萌發具有明顯的促進作用。除此之外，生菜生理對鎘毒害閾值及響應程度也存在較大差異，且這些研究大多集中在水培條件下[7-8]，無法全面反應生菜的田間栽培情況。因此本文以生菜為材料，水培和基質栽培相結合，研究鎘脅迫下生菜種子萌發、生物量、生理生化反應和生菜體內及亞細胞中鎘的累積特征，探討生菜對鎘脅迫的響應及鎘累積的規律，為生菜鎘的毒理學研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試生菜品種為美國大速生（Lactuca sativa var.capatata L.），種子購自北京開心格林農業科技有限公司。供試蛭石和草炭（pH5.6，有機質含量75%，C/N為50∶1）為德國進口TS-1型。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗材料處理

挑選籽粒飽滿、大小一致的生菜種子，用1%的次氯酸鈉溶液消毒10 min，再用去離子水清洗干凈后放入33℃左右的溫水中浸泡30 min，然后播于鋪有兩層濾紙的玻璃培養皿中，每皿30粒，置于（15±2）℃無光培養箱。每日加10 mL不同濃度鎘（0、0.5、1、5、10、20 mg·L-1，鎘以CdCl2的形式添加）的培養液，各處理均重復3次。4 d后測定發芽勢（以胚根長度為種子縱徑長度一半為標準），7 d后測定發芽率[9]。

發芽勢=4 d內供試種子發芽數/供試種子數×100%

發芽率=7 d內供試種子發芽數/供試種子數×100%

相對生長量=處理組/對照組×100%

將催芽后的種子播種于盛有基質（草炭∶蛭石=2∶1，V∶V）的穴盤中，每穴2～3粒，放入光照培養箱中培養（白天夜晚時長14 h/10 h，溫度20℃/15℃，光照強度12 000 lx/0 lx），2周后用1/4 Hoagland完全培養液[9]進行培養，4周后從穴盤移栽至盆缽（8 cm×6 cm×10 cm，基質與穴盤中的一樣）中，每盆1顆，同時營養液用1/2 Hoagland培養液，6周后開始澆灌添加了不同濃度鎘（0、5、10、20、50、100、200 mg·L-1，鎘以CdCl2的形式添加）的Hoagland完全培養液，每個處理15盆。脅迫10 d后采樣，測定生理生化指標。脅迫21 d后采樣測定生菜的生物量。

1.2.2 測定項目及方法

1.2.2.1 生菜體內鎘含量的測定

將生菜從基質中取出依次用自來水、高純水洗滌，擦干水分后將地下與地上部分分開，稱量各部分鮮質量（FW）。于105℃殺青30 min，65℃烘干至恒質量，稱量干質量（DW），烘干后的樣品研磨過100目篩。稱取0.25 g樣品于消解管中，加入2 mL硝酸（1∶1，V∶V）靜置過夜，消解管于電熱板上120℃低溫消解4 h，其間搖動消解管以排除消解過程中產生的氣體，將電熱板升溫到140℃繼續消解30 min，從電熱板上取下樣品冷卻至室溫后用高純水定容至10 mL。消解完成的樣品用電感耦合等離子體發射光譜（ICPOES）測定鎘含量，并計算生物富集系數及轉運系數。

生物富集系數（BCF）=植株組織中鎘含量/基質中鎘含量

轉運系數（TF）=植株地上部分鎘含量/植株地下部分鎘含量[10]

1.2.2.2 生菜生理生化指標的測定

處理結束后，取生菜的成熟功能葉片。葉綠素采用丙酮浸提、分光光度法測定[6]；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定[9]；SOD活性采用氮藍四唑光還原法測定[11]；POD活性采用愈創木酚法測定[9]；CAT活性采用碘量法測定[9]。

1.2.2.3 生菜苗期亞細胞內鎘含量的測定

亞細胞組分的提取參照Xin等[12]的方法。取新鮮的生菜根系或地上部分1 g置于10 mL預冷（4℃）的提取液[50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）、250 mmol·L-1蔗糖和 1.0 mmol·L-1C4H10O2S2]中研磨成勻漿，3000 r·min-1離心15 min，沉淀即為細胞壁組分（包括細胞壁和細胞壁碎片），上清液繼續12 000 r·min-1離心30 min，沉淀和上清液分別稱為細胞器組分和可溶組分（包括細胞液和液泡），分離后的各組分裝入10 mL離心管中，經硝酸消化后用ICP-OES測定鎘含量。

1.3 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2003及SPSS 16.0進行數據分析，采用LSD檢驗法進行差異顯著性分析（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 鎘濃度對生菜種子萌發的影響

用于反映種子萌發的重要參數是發芽勢和發芽率，發芽勢反映種子的發芽速度和整齊度，發芽率反映種子發芽多少，是發芽生境和種子質量的綜合反映。表1和圖1是不同濃度的鎘對生菜種子萌發的影響。可以看出，鎘脅迫使生菜種子發芽勢顯著下降，當鎘濃度≥10 mg·L-1時，發芽勢均為零。1 mg·L-1的鎘顯著提高了生菜種子的發芽率，而其他濃度鎘都顯著降低其發芽率，當鎘濃度達20 mg·L-1時僅為19.8%，是對照的22.3%。

2.2 鎘對生菜中葉綠素含量的影響

不同濃度鎘對生菜葉綠素含量的影響見表2。可以看出，鎘濃度為5 mg·L-1時，葉綠素總量和葉綠素a含量顯著高于對照，葉綠素b的含量與對照之間差異不顯著。當鎘濃度在10～200 mg·L-1的范圍內，葉綠素含量均顯著低于相應對照。葉綠素a/葉綠素b在5～20 mg·L-1時，顯著高于對照；鎘濃度繼續增加，生菜葉綠素a/葉綠素b與對照無顯著差異。

表1 鎘脅迫對生菜種子萌發的影響Table 1 Effects of Cd stress on seed germination of lettuce

圖1 處理4 d后生菜種子發芽情況Figure 1 Seed germination of lettuce after 4 d Cd stress

表2 鎘脅迫下生菜葉綠素含量的變化Table 2 Effects of Cd stress on the chlorophyll contents in leaves of lettuce

2.3 鎘對生菜葉片MDA含量的影響

植物體內的MDA是膜脂過氧化的主要產物，它的高低可以反映植物體內過氧化作用的強弱。從圖2可以看出，鎘濃度為5 mg·L-1時，生菜體內MDA含量顯著增加，為對照的1.64倍；隨鎘濃度的進一步增加，與對照相比，除20 mg·L-1時MDA出現顯著下降外，其他處理無顯著差異。

2.4 鎘對生菜生物量的影響

生物量是植物各種生境條件及自身特征的綜合表現，表3是不同濃度鎘對生物量的影響。與對照相比，除地下部分鮮質量外，50、100 mg·L-1鎘對生物量干質量、鮮質量總量及各部分都有顯著促進作用；其他濃度鎘對生物總量及各部位干、鮮質量雖有影響，但統計學上沒有顯著差異（除去5 mg·L-1鎘對地上部分干重顯著增加外）。在本研究鎘濃度范圍內，無論鮮質量還是干質量，鎘脅迫對生菜生物量的分配即根冠比與對照相比都無顯著差異。

2.5 鎘對生菜抗氧化酶活性的影響

圖2 鎘脅迫下生菜葉片丙二醛（MDA）含量的變化Figure 2 Effects of Cd stress on MDA concentration in leaves of lettuce

植物體內抗氧化保護酶活性的高低是反映植物對逆境適應的重要指標。表4是不同濃度鎘對生菜成熟葉片中SOD、POD和CAT 3種抗氧化酶活性的影響。可以看出，隨著鎘濃度的升高，SOD的活性顯著下降，200 mg·L-1時最低，比對照下降23.3%；而CAT的活性表現出先升高后下降的規律，鎘濃度為20 mg·L-1時達到最高，高出對照38.1%，鎘濃度為200 mg·L-1時，降低到對照的水平；POD的活性顯著升高，到200 mg·L-1時，達到最大值，是對照4.56倍。說明生菜體內3種酶對鎘脅迫的響應存在差異。

表3 鎘脅迫下生菜生物量的變化Table 3 Effects of Cd stress on lettuce biomass

表4 鎘脅迫對生菜抗氧化酶活性的影響Table 4 Effects of Cd stress on activities of antioxidant enzymes in lettuce

2.6 鎘脅迫對生菜地上、地下部分鎘含量的影響

表5是不同濃度鎘處理下生菜苗期體內鎘的含量。生菜地下部分（根系）和地上部分鎘含量均隨鎘濃度的升高而顯著增加，但其變化趨勢存在一定的差異。生菜根系中鎘含量隨鎘濃度的增加呈線性累積趨勢（y=6.17x-13.70，R2=0.93），而地上部分呈對數累積（y=49.00 lnx-46.97，R2=0.99）。且在同一鎘濃度下，地下部分鎘含量顯著高于地上部分，特別是當鎘濃度為200 mg·L-1時，地上部分鎘含量僅為地下部分的15.7%。隨鎘濃度的升高地上部分的生物富集系數逐漸下降，而地下部分呈現先升高后下降的趨勢，同時地下部分明顯高于地上部分；轉運系數隨鎘濃度的增加顯著下降，說明生菜根系中鎘向地上部分轉運能力在下降。

2.7 鎘在生菜亞細胞組分中的分布

生菜亞細胞水平上鎘含量（以鮮重計）見表6及表7。隨著添加鎘濃度的增加，地下部分亞細胞中各部分鎘含量呈現指數累積趨勢，且累積程度大小為細胞壁＞可溶組分＞細胞器；地上部分亞細胞中鎘含量呈直線累積趨勢，且累積程度大小為細胞壁、可溶組分＞細胞器。地下部分累積的速度遠遠高于地上部分的速度；基質中同一鎘濃度時，地上部分亞細胞中的鎘含量遠低于地下部分，當鎘濃度為200 mg·L-1時，根系中細胞鎘含量是地上部分的33.7倍。

圖3是生菜地下部分和地上部分亞細胞各部分中鎘含量的分布比例。地下部分亞細胞中的分布比例是細胞壁＞可溶組分＞細胞器（除基質中最大鎘濃度時：細胞壁＞細胞器＞可溶組分外）。鎘主要分布在細胞壁上，占總量的49.6%～61.4%，其次是可溶組分中，占總量的17.9%～33.1%；二者總和占比79.3%～86.7%，且隨著基質中鎘濃度的增加呈現直線下降的趨勢（y=-0.02x+84.04，R2=0.50）；在細胞器中占比最少（13.3%～20.7%），且隨著基質中鎘濃度的增加呈直線增加的趨勢（y=0.02x+15.95，R2=0.51）。地上部分中亞細胞各部分鎘含量在細胞壁和可溶組分中所占比例相差無幾，二者之和高達總量的75.3%～84.2%，并且隨基質中鎘濃度的增加，二者所占比例直線增加（y=0.05x+75.37，R2=0.86），而細胞器中鎘含量所占比例卻顯著下降（y=-0.05x+24.59，R2=0.86）。

表5 鎘脅迫對生菜地上、地下部分鎘含量（DW）的影響Table 5 Effects of Cd stress on Cd contents in the upper and underground parts of lettuce

3 討論

3.1 鎘脅迫對生菜發芽、生物量及葉綠素含量的影響

種子萌發是植物對外界脅迫最敏感的階段[13]，通過觀察生菜種子發芽對外源鎘的響應，可以更系統地認識鎘脅迫對植物的毒害。種皮對重金屬脅迫具有一定屏障作用，但當種子吸水膨脹，胚根萌動突破種皮時，胚根最早受到鎘毒害，并隨著細胞分裂、胚根的發育，鎘越來越多的聚集在胚根生長點附近，并誘導細胞產生乙烯直接傷害根部組織，使得胚根端部變黑而停止生長[14]，從而降低發芽速度。本研究結果驗證了這一點：鎘脅迫的生菜種子發芽勢都顯著低于對照，且隨著鎘濃度的增加，發芽勢明顯降低。相對于胚根，重金屬對胚芽的影響卻表現出階段性和多元化特征[15]。隨著種子的進一步萌發，一定濃度鎘提高種子萌發初期蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等相關酶的活性，加速胚乳中營養物質的降解，從而促進其萌發代謝，提高種子發芽率[4]；而高鎘脅迫又會抑制相關酶的活性，使得種子內存儲的營養物質分解速率降低，導致種子萌發所需物質和能量獲取不足，從而降低其發芽率[2，4]。這一規律在本研究種子發芽率試驗中得到體現：一定濃度（1 mg·L-1）鎘對生菜種子發芽率有明顯促進作用，但過低（0.5 mg·L-1）或過高（≥5 mg·L-1）濃度鎘脅迫都顯著降低其發芽率。其與徐劼等[8]研究結果一致：低濃度促進種子發芽，高濃度抑制種子發芽。

表6 鎘脅迫下生菜亞細胞組分中鎘的分布（μg·g-1FW）Table 6 Cd distribution in subcellular fractions of lettuce under Cd stress（μg·g-1FW）

表7 生菜亞細胞與基質中鎘含量的關系Table 7 Relationship between Cd contents in subcellular fractions of lettuce and in substrate

圖3 生菜各亞細胞組分中鎘的分配比例Figure 3 Distribution percentages of Cd in subcellular fractions of lettuce

當作物根系累積到一定量的鎘后，不僅嚴重干擾根系代謝，還影響養分、水分向地上部分轉運[3]。轉運到地上部分的鎘會使葉綠素合成受阻，特別是葉綠素a、葉綠色b及葉綠色a/b會受到不同程度的影響[8]。葉綠體受到光照時，在光合系統Ⅰ的還原端產生活性氧，從而啟動膜脂過氧化，但植物體內相關酶具備自由基清除功能，使活性氧的產生與清除維持平衡，繼而減緩對植物光合作用的影響；當植物受到環境脅迫時，這種平衡將被打破，葉綠素含量下降[16]。葉綠素b具有光能吸收和傳遞作用，而葉綠素a起著光能捕獲和電荷分離的雙重作用[17]，這可能導致葉綠素a相對于葉綠素b對環境脅迫更為敏感[16]，最終導致植物光合能力下降。本研究表明（表2和表3）：與對照相比，低濃度鎘（5 mg·L-1）對生菜葉綠素總量及葉綠素a有促進作用，葉綠素b無顯著差異；隨著鎘濃度的增加，三者都顯著下降；生物量的響應相對遲緩，當50、100 mg·L-1鎘脅迫，生菜生物量總量及地上部分較對照顯著升高，在200 mg·L-1才顯著下降。這可能與環境脅迫植物自我保護系統有關[4]。

3.2 生菜對鎘脅迫的生理響應

植物受到外界脅迫時植株體內會產生大量的活性氧自由基，促使細胞膜內的不飽和脂肪酸發生過氧化反應產生MDA，其含量可反映機體內脂質過氧化的程度以及細胞膜受損傷程度[2]。鎘是質膜過氧化的重要誘變劑[18]，高濃度的鎘誘導會產生較多MDA，這在很多研究[19-21]中都已證實。本研究中鎘濃度在5 mg·L-1時MDA含量顯著高于對照，更高的鎘濃度與對照無顯著差異或顯著低于對照。這一結果似乎與大多數研究存在差異[19-21]，其可能原因是：MDA的含量不僅與鎘脅迫濃度有關，而且隨脅迫時間的延長呈現先升高而后下降趨勢。本研究之所以看到隨鎘濃度（＞5 mg·L-1）升高，MDA值維持不變或降低的結果，可能與只測定了鎘脅迫一段時間后成熟葉片的MDA值有關。在此期間，鎘脅迫下生菜自身會產生一系列的生理生化變化來最大可能地降低鎘的毒害。首先，根系盡可能通過阻滯鎘向地上部分的轉移，降低地上部分鎘總量來保護地上部分組織[23]。從表5中的轉運系數看出，隨著鎘濃度的增加，生菜的轉運系數顯著下降。這一結果成為鎘在植株體內分布的普遍規律：地下部分＞地上部分[2]。其次，植物通過維持或增加干物質量，以延緩鎘在體內含量的快速增加，從而降低其對植株的毒害。表3中，無論是總量，還是地上、地下部分，相對于對照處理，一定量的鎘濃度（50、100 mg·L-1）促使生菜生物量顯著增加，其他濃度對生物量無顯著影響。再者，植物可以將鎘吸持到非活性部位以降低鎘的毒害，通過細胞壁的固持阻礙鎘進一步進入細胞內；即便進入，細胞質內的谷胱甘肽、草酸、檸檬酸鹽等可對鎘進行螯合或沉淀，以避免與細胞器接觸，降低其毒害[23]。從圖3中看出，無論是地上部分還是地下部分，鎘在生菜亞細胞中的分布比例都說明了以上解毒機制：細胞壁＞細胞質＞細胞器。這與大多數研究結果一致：細胞器的鎘含量最低，細胞壁等非活性部分的固持作用是耐鎘的重要機制[24，25]，生菜對鎘的耐受可能也源于此。

植株體內保護酶體系也是植物對于逆境脅迫至關重要的保護機制[2，29]。植物遭受鎘脅迫后產生的自由基隨抗氧化系統（SOD、POD、CAT等）的啟動而被清除，以防止膜脂過氧化[26]。其中，產生的超氧陰離子自由基主要由SOD清除，而將產生的H2O2分解為O2和H2O的主要酶是POD、CAT，這些酶活性的變化可以反映植物的抗性[27]。鎘脅迫下這3種酶活性因植物抗性強弱而存在差異[23]。本研究（表4）顯示：隨著鎘濃度的升高，SOD活性下降，其結果與田丹等[7]對生菜的研究不同：隨著鎘濃度的增加，SOD活性先增加，而后弱有下降；CAT的活性隨著鎘濃度升高是先上升后下降，這與大多數研究結果非常一致[23]，表明CAT活性的變化對生菜的膜系統具有一定的保護作用；而POD的活性隨鎘濃度升高呈極顯著的直線上升，這與大多數研究結果一致[7，28]。有研究認為：POD活性的增強是植物耐鎘的主要酶類[4，29]，因此POD也可能是生菜耐鎘的主要酶類。3種酶類相互協調，最終導致成熟生菜葉片MDA值隨著鎘濃度（＞5 mg·L-1）升高無明顯增加趨勢，正如張金彪等[2]對3種酶在鎘毒害保護機制方面的陳述：植物細胞存在著自由基的產生和消除兩個過程，只有SOD、CAT和POD三者協調一致，才能使自由基維持在一個較低水平，避免其毒害。

4 結論

（1）鎘脅迫顯著降低生菜發芽勢；1 mg·L-1鎘脅迫顯著提高發芽率，其他濃度顯著降低發芽率。

（2）低濃度（5 mg·L-1）鎘顯著促進葉綠素總量和葉綠色a含量；高濃度鎘（10～200 mg·L-1）顯著降低葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b含量；鎘脅迫對根冠比沒有顯著影響；隨著鎘濃度的升高，SOD的活性顯著下降，CAT的活性先升高后下降，POD的活性顯著升高。

（3）地下部分鎘含量顯著高于地上部分；隨鎘濃度的升高，地上部分的生物富集系數逐漸下降，而地下部分呈現先升高后下降的趨勢；轉運系數隨鎘濃度的增加顯著下降；鎘在亞細胞分布存在以下規律：地下部分為細胞壁＞可溶組分＞細胞器，地上部分為細胞壁、可溶組分＞細胞器。地下部分（根系）的滯留作用和細胞壁的固持是生菜應對鎘脅迫的重要耐性機制。