三種微生物對鈾脅迫下鳳眼蓮熒光生理及鈾累積特性的影響

鄧聞楊，羅學剛，羅 藍，王 焯

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2.西南科技大學核廢物與環境安全國防重點學科實驗室，四川 綿陽621010；3.西南科技大學環境與資源學院，四川 綿陽 621010）

目前，原子能的應用在世界范圍內得到普及，促發了鈾礦的大量開采與冶煉，在應用的同時，也產生了大量的鈾礦冶三廢，其中的放射性重金屬通過地表水流沖刷以及地下水滲透等方式進入地球水循環，形成放射性廢水。這些放射性廢水的存在，會對生態圈造成危害，如通過生物鏈進入人體，以體內輻射以及化學毒性的方式損害人體健康，并且由于放射性廢水量大、半衰期長的特點，危害將會長期存在[1-2]。因此，近年來對鈾礦廢水的處理成為國內外的研究熱點。

廣泛使用的鈾礦廢水修復方法有物理法、化學法和生物修復法。生物修復法由于方法簡便、無二次污染的特性，且可以通過資源化使修復過程具有其他經濟效益，所以擁有較好的前景[3]。生物修復中主要用到的是植物與微生物兩種修復材料，二者在重金屬修復中具有不同的作用機制及效果。Lee等[4]利用根際過濾方法修復含鈾地下水，結果表明：向日葵能在24 h內去除鈾廢水中超過80%的鈾，處理后的鈾濃度低于30 μg·L-1。Tsuruta[5]研究發現煙草節桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌對鈾具有高效吸附作用。但是由于修復環境本身的毒害性，導致植物修復與微生物修復都有修復時間緩慢、修復效率不高的缺點[6]。而研究表明，微生物和植物的聯合使用，能夠通過二者間的相互作用，顯著增加修復的效果，因此重金屬修復領域的微生物-植物互作研究成為熱點[7]。Eapen等[8]利用發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）與芥菜型油菜（Brassica juncea）和莧色黎（Chenopodium amaran?ticolor）進行聯合修復，結果表明2種植物根部富集鈾的能力顯著增強。

鳳眼蓮（Eichhornia crassipes）具有較發達的棕色根系，適應能力極強。有研究表明，鳳眼蓮由于其本身特性而對重金屬具有良好的富集能力[9-12]。膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）和枯草芽孢桿菌（Ba?cillus subtilis）在自然界都具有重要作用，能釋放較多激素和酶促進植物生長及抗病害能力[13-14]。黑曲霉（Aspergillus niger）作為一種產檸檬酸的功能菌種，目前也已廣泛應用于重金屬修復中。因此本實驗選用水培的方法，接種3種微生物進行微生物-植物聯合修復，期望對以后水體的植物-微生物聯合修復起一定的理論支撐作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鳳眼蓮（Eichhornia crassipes）幼苗購自綿陽市信捷商貿有限責任公司。

膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由西南科技大學生物質材料教育部工程研究中心提供，黑曲霉（Aspergillus niger）由西南科技大學核廢物與環境安全國防重點學科實驗室提供。

1.2 處理設計

高濃度重金屬對植物存在較強的脅迫毒害作用，普遍采用U濃度為0.5～50 mg·L-1[10-12]。本實驗U濃度設置為0、5、15、25 mg·L-1，各濃度下設置3個微生物處理組及對照組：CK（對照組）、K（枯草芽孢桿菌）、J（膠質芽孢桿菌）、H（黑曲霉），共16個處理組，每個處理設置3個重復。

1.3 實驗設計

1.3.1 微生物活化及培養

細菌采用LB液體培養基，胰蛋白胨10 g、浸出酵母粉5 g、NaCl 10 g、H2O 1 L；真菌采用PDA固體培養基（土豆200 g，加水煮沸20 min，過濾得過濾液加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g，定容1 L。活化3 d后，接種擴大培養4 d，保存于4℃下備用[15]。

1.3.2 大棚實驗

試驗前在試驗場用不含U污染的水體對鳳眼蓮進行7 d的環境馴化。使用10 L透明水桶做試驗容器，用UO2（CH3COO）2·2H2O濃縮液和5加侖桶裝純凈水（購自綿陽西科水電安裝工程有限公司清源水廠）配制各U濃度以模擬U污染水體，體積為5 L，加入1/10 Hoagland營養液，0.5 g NH4NO3，5 g C6H12O6·H2O。取馴化后長勢相同的鳳眼蓮加入配制好的模擬水體中（鮮重14 g±1 g），并在桶中放入一塊滅菌海綿（做前期微生物載體）[15]，使鳳眼蓮根系緊靠海綿。做好液面標記，隔天補充純凈水，使體積恒定。試驗在西南科技大學核素生物效應試驗場溫室大棚中進行，大棚通風及透光性能良好，溫度高于30℃自動風控降溫。

1.3.3 微生物接種

兩種細菌在4 ℃下，8000 r·min-1離心20 min。菌泥用無菌水稀釋，于600 nm處測定OD值為0.5。真菌用無菌水沖刷，制成孢子懸液，于560 nm[16]處測定OD值為0.3。接種時兩種細菌菌懸液5 mL，真菌孢子懸液5 mL，各自接種于滅菌海綿上。開始培養后每隔4 d接種一次，共4次。

1.3.4 葉綠素熒光參數測定

培養14 d后隨U對鳳眼蓮脅迫時間增加，鳳眼蓮葉片會逐漸出現泛黃、萎焉等不利于數據測定的現象，因此在14 d時測定葉綠素熒光參數，采用M-PEA熒光儀（英國Hansatech公司），測量前先將葉片暗適應20 min，再進行測定[17]。

1.3.5 抗氧化酶活性測定

14 d時測定抗氧化酶系統，稱取0.2 g剪碎后的新鮮植物葉片于預冷的研缽中，加入相應的緩沖液在冰浴中研磨成勻漿，在4℃下離心，上清液即為相應的酶粗提液。SOD的測定使用氮藍四唑（NBT）光化還原法，以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活性單位（U·g-1）[18]。POD 的測定使用愈創木酚法，以每分鐘A470變化0.01為1個 POD活性單位（U·g-1·min-1）[19]；CAT的測定采用過氧化氫法，以每分鐘A240變化0.01為1個活性單位（U·g-1·min-1）[20]；

1.3.6 植物收獲及數據測定

培養21 d，鳳眼蓮吸附U濃度趨于穩定時收獲鳳眼蓮。用自來水清洗后再用去離子水清洗2～3次，分開根系與莖葉[21]。分別在105℃下殺青30 min，后調溫80℃烘干至恒質量，分別用電子分析天平（德國Sartorius集團）稱量各部分干質量。用高速萬能粉碎機（北京永光明醫療儀器有限公司）粉碎各部分，稱取0.2 g樣品，150℃用微波消解儀（意大利Milestone公司）進行消解，消解前加入5 mL濃硝酸（65%～68%HNO3）與2 mL 30%H2O2。消解完成后將消解液定容至50 mL，用孔徑為0.45 μm針孔濾膜進行過濾后，用電感耦合等離子發射光譜質譜儀（Agilent 7700x ICP-MS，美國安捷倫科技有限公司）測定U含量。

1.4 數據處理[22]

局部富集量（mg）=富集濃度（mg·g-1）×干質量（g）

總富集量（mg）=莖葉富集量（mg）+根系富集量（mg）

整體富集濃度（mg·g-1）=總富集量（mg）/總干質量（g）

轉移系數（TF）=莖葉富集濃度（mg·g-1）/根系富集濃度（mg·g-1）

生物富集系數（BCF）=整體富集濃度（mg·kg-1）/U處理濃度（mg·L-1）

利用DPS 7.5進行數據分析；Origin Pro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 微生物對鳳眼蓮U脅迫下生物量的影響

圖1a表明，在無U存在時，接種3種微生物會抑制鳳眼蓮根系干質量，但隨著U處理濃度升高，微生物會在不同濃度下表現出對鳳眼蓮根系的促生作用。其中，在5 mg·L-1時，J對比CK增長最明顯，干質量達0.417 8 g，增長36.2%；15 mg·L-1時，H與J對比CK組分別增長20.2%與42%；25 mg·L-1時，K組鳳眼蓮根系增長最明顯，根系干質量為0.257 1 g，增長達34.8%。

由圖1b可以看出，CK組莖葉干質量隨著U處理濃度升高，表現出先升高后降低的趨勢，K組則表現出較平穩的現象，H與J組則隨U處理濃度升高表現出促進莖葉干質量的現象。在0、5 mg·L-1時，K組鳳眼蓮莖葉干質量分別達0.425 0 g及0.405 2 g，對比同濃度下的CK組，分別增長296.1%及34.8%；15 mg·L-1下，3種微生物皆使鳳眼蓮莖葉干質量降低；25 mg·L-1時，3種微生物對鳳眼蓮莖葉干質量皆有促進作用，J組促進作用最明顯，鳳眼蓮莖葉干質量達0.530 6 g，較CK組增長60.5%，H與K組增長分別為23.7%及22%。

圖1 不同濃度U及微生物處理下鳳眼蓮根系（a）及葉（b）干質量Figure 1 The root（a）,stem and leaf（b）dry weight of Eichhornia crassipes under treatments of different concentration of U and microbial

2.2 微生物對鳳眼蓮U脅迫下抗氧化酶系統的影響

由圖2可以看出，CK組的鳳眼蓮CAT活性隨U處理濃度升高而下降，POD、SOD活性則隨U處理濃度升高呈現出先下降后升高的趨勢。H組鳳眼蓮3種酶活的變化趨勢與CK組相似，POD活性在15、25 mg·L-1下較CK組有所提高，分別增長27.5%及47.7%，但CAT、SOD活性在各濃度下較CK組皆有降低的趨勢；J組POD、CAT活性都呈現出隨U處理濃度升高而先升高后降低再升高的趨勢，其中POD活性在15、25 mg·L-1下高于CK組，分別增長14.4%及32.2%，CAT活性在5、25 mg·L-1時超過CK組，分別增長19.7%及83.9%，SOD活性則隨U處理濃度升高而先升高后降低，分別在5、15 mg·L-1下高于CK組，分別增長202.9%及112.2%；K組鳳眼蓮3種酶活都呈現隨U處理濃度升高而下降的趨勢，其中POD及SOD活性都在5、15 mg·L-1時超過CK組，POD活性增長分別為73.6%及16.6%，SOD活性增長分別為193%及76.6%，CAT活性則在15、25 mg·L-1下超過CK組25.2%及15.8%。

2.3 微生物對鳳眼蓮U脅迫下葉綠素熒光參數的影響

由圖3a可以看出，CK組鳳眼蓮的PSⅡ最大光化學效率（FV/Fm）隨著U處理濃度升高而呈先升高后降低的趨勢，微生物處理下則表現出先降低后升高的趨勢。在0、15、25 mg·L-1下，3種微生物皆能提高植物的FV/Fm，5 mg·L-1時則有下降的趨勢；其中H組鳳眼蓮的FV/Fm提升最為明顯，在0、15、25 mg·L-1下，分別對比CK提高了13.2%、20.5%和21.2%。

由圖3b和圖3c可以看出，CK的葉片光化學性能指數（PIabs）和植物葉片的可變熒光強度（Vj）隨U處理濃度升高而逐漸升高，各微生物處理組則皆先升高后下降。在0 mg·L-1時，微生物處理對PIabs和Vj沒有明顯的影響，但在5、15 mg·L-1時超過CK，25 mg·L-1下低于CK。其中H組在5、15 mg·L-1下，鳳眼蓮PIabs和Vj提升最明顯，PIabs分別增長142.3%和216.7%，Vj分別增長48.6%和15.8%。

2.4 微生物對鳳眼蓮U累積特征的影響

圖4a和圖4b表明，不同微生物會影響鳳眼蓮各部分對U的吸收能力。其中5 mg·L-1時，K組鳳眼蓮根系吸附能力比CK增長8.2%，H組莖葉吸附能力比CK增長9.2%；15 mg·L-1時，H組鳳眼蓮的根系吸附能力提升最明顯，比CK增加10.1%，K組莖葉吸附能力提高最明顯，比CK增長28.4%；25 mg·L-1時，H組與J組的根系吸收能力表現出較大的提高，吸附濃度分別為7.51 mg·g-1和8.42 mg·g-1，對比CK分別增長22%及36.6%，同時，H組與K組的莖葉吸收能力有明顯的提升，對比CK分別增長8.8%及14.1%，吸收濃度分別為4.17 mg·g-1和4.37 mg·g-1。

考慮到整株植物的生物量等因素，可以從圖4c和圖4d得出微生物對鳳眼蓮整體修復效果的影響。可以看出，隨著U處理濃度的升高，微生物對整株植物U吸收能力及U總提取量的提升也逐漸明顯。5 mg·L-1時，僅有H組鳳眼蓮整體吸附濃度高于CK，但吸附量最低；15 mg·L-1時，H組與K組整體吸附濃度高于CK，其中K組的提升最明顯，較之CK增長16%，但是吸附量也是最低的；25 mg·L-1時，各微生物處理組在兩個指標上均表現出較高的提升作用，其中整株吸附濃度表現為H＞J＞K＞CK，H組的整株吸附濃度最高為5.28 mg·g-1，對比CK增長了12.7%，U的總提取量表現為 J＞H＞K＞CK，J組的 U總提取量最高為3.71 mg，較CK提高51.8%。

圖2 不同濃度U及微生物處理下鳳眼蓮的POD（a）、CAT（b）及SOD活性（c）Figure 2 POD（a）,CAT（b）and SOD（c）activity of Eichhornia crassipes cultured with different concentrations of U and microorganisms

由表1可以看出，在不同濃度下，不同微生物處理將會對鳳眼蓮的TF及BCF產生不同的影響。5 mg·L-1下，僅H組鳳眼蓮TF提高，對比CK增長7.9%；15、25 mg·L-1下，K組鳳眼蓮的TF有明顯的提升，對比CK增長分別達29.6%及24.4%。對于BCF，5 mg·L-1下與TF表現一樣，僅H組比CK提高了4.5%；15 mg·L-1下，K組與H組的BCF有上升趨勢，對比CK分別增長16%及8.9%；25 mg·L-1下3種微生物皆對植物BCF有促進作用，表現為H＞J＞K＞CK，對比CK增長分別為12.7%、8%及3.9%。

圖3 不同濃度U及微生物處理下鳳眼蓮的FV/Fm（a）、PIabs（b）及Vj（c）Figure 3 FV/Fm（a）,PIabs（b）and Vj（c）of Eichhornia crassipes cultured with different concentrations of U and microorganisms

3 討論

圖4 不同濃度U及微生物處理下鳳眼蓮根系（a）、莖葉（b）、整株U吸收濃度（c）及整株U提取量（d）Figure 4 Root（a）,stem and leaf（b）and the whole plant（c）of Eichhornia crassipes absorbs the concentration of U,and the The amount of U extraction of whole plant（d）of Eichhornia crassipes under treatments of different concentration of U and microbial

生物量是植物對逆境脅迫響應的綜合體現與常用指標[23]。微生物處理對鳳眼蓮各部位生物量的影響趨勢相似，皆是在較低濃度下對生長產生抑制，隨著U處理濃度升高，逐漸表現為促進作用，25 mg·L-1時，枯草芽孢桿菌使鳳眼蓮根系干質量增長達34.8%，膠質芽孢桿菌使鳳眼蓮莖葉干質量增長60.5%。有研究表明，微生物可以釋放大量的有機酸，參與重金屬元素的吸收、運輸、積累等過程，有機酸的釋放亦可酸化植物生長微環境[7]。在0 mg·L-1時，微生物對鳳眼蓮的生長有抑制作用，這可能是由于微生物自身釋放的有機酸等，在較低U濃度下改變了植物根系環境，抑制了植物的生長，而隨著U處理濃度升高，不同微生物釋放的有機酸與重金屬結合，降低了酸性環境的刺激及重金屬毒性，提高了植物的抗脅迫能力，促進植物生長。但其中枯草芽胞桿菌對鳳眼蓮莖葉在較低U濃度下也具有良好的促進作用，這可能是由于其微生物本身的莖葉促生功能[24]。

由于U的化學毒性而使植物體內產生過多的自由基和過氧化物，這些自由基及過氧化物由POD、CAT和SOD的共同作用去除[25-26]。黑曲霉使植物三種酶活普遍下降，這可能是因為黑曲霉釋放的有機酸等物質，螯合了重金屬并減少其毒性，提高了植物對U的耐受性。而另外兩種微生物則對鳳眼蓮抗氧化酶活性在不同濃度下有不同的影響，膠質芽胞桿菌在0 mg·L-1時，極大地降低了三種酶活性，但隨U處理濃度升高，卻提高了三種酶活，這可能是由于膠質芽孢桿菌本身對植物有較強的促生作用，能減少周圍環境對植物的不利影響，但在U脅迫下，也會對U的毒性更加敏感，與膠質芽孢桿菌類似，枯草芽孢桿菌也使得較低U濃度下三種酶活性明顯提升，可能是提高了植物對低濃度U的敏感度，間接啟動植物自身的抗脅迫機制。有研究表明，微生物-植物聯合修復體系中微生物通過啟動植物自身內部的響應機制來提高抗脅迫能力[27-29]，但枯草芽孢桿菌不具備使植物對環境耐受的作用。總體而言，膠質芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌能在不同時期提高植物抗氧化酶活性以應對重金屬脅迫，這與朱靖[30]施加EM菌劑后植物抗氧化酶活性上升現象一致。

葉綠素熒光成像技術利用植物葉綠素熒光原理來得到植物光合作用狀態、葉片異質性等直觀的信息，是一種便捷、無損害的研究手段[31]，其中Fv/Fm反映了光系統Ⅱ反應中心的能量捕獲率，一般植物恒定在0.75～0.85，遭受脅迫時這個值顯著下降[32-33]，PIabs和Vj能綜合反映PSⅡ所受的影響[17]。三種微生物的接種，對鳳眼蓮FV/Fm、PIabs和Vj指標皆有一定的影響。就整體而言，三種微生物的接種使FV/Fm普遍升高，PIabs和Vj也在一定濃度下有明顯的提升，其中皆以黑曲霉的提升效果最佳。這證明在一定的U濃度脅迫下，微生物能增強PSⅡ系統的功能，黑曲霉的促進效果最明顯，這可能是由于黑曲霉的代謝產物螯合重金屬，減少其毒性的原因。

表1 不同濃度U及微生物處理下鳳眼蓮的TF、BCFTable 1 The TF,BCF of Eichhornia crassipes under treatments of different concentration of U and microbial

微生物處理能明顯提高植物各部位富集U的能力及總提取量。25 mg·L-1時，膠質芽孢桿菌使鳳眼蓮根系吸收濃度提升最明顯，吸收濃度為8.42 mg·g-1，比CK增長36.6%，枯草芽孢桿菌使鳳眼蓮的莖葉吸收能力提升最大，比CK增長14.1%，吸收濃度為4.37 mg·g-1，膠質芽孢桿菌使鳳眼蓮的U總提取量達到最高，為3.71 mg，較CK提高51.8%。有相關研究表明，根際微生物的代謝可把一些大分子化合物轉化為小分子化合物，這些轉化產物如有機酸、鐵載體和生物表面活性劑等對植物根際的重金屬有顯著的活化作用，微生物分泌的螯合物還可與植物體內重金屬結合，改變重金屬在植物體內的存在形態[34]，促進植物吸收。但其中較高濃度時枯草芽孢桿菌降低了植物根系富集能力，可能是基于微生物作用下某些重金屬的直接減量以降低重金屬對植物毒害作用，而膠質芽孢桿菌對植物莖葉富集能力也產生抑制，可能是通過阻隔了其向地上部轉移，從而間接地提高植物的抗性，而這也正好符合接種膠質芽孢桿菌后，鳳眼蓮TF降低最明顯的現象。就整體富集特征而言，15 mg·L-1下，接種枯草芽孢桿菌的TF最高，為19.2，5 mg·L-1下接種黑曲霉的BCF最高，為272.8，證明微生物對鳳眼蓮的轉移能力及U吸附能力都有明顯的促進。

4 結論

枯草芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌和黑曲霉三種微生物在U污染水體的植物修復中具有一定積極的作用，能顯著提高鳳眼蓮在U污染水體中的生物量、富集濃度、吸附量等指標，其中接種膠質芽孢桿菌整體吸附效果最好。生理生化指標證明微生物對植物抗氧化系統及PSⅡ系統在U脅迫下具有一定的正面效果。對植物-微生物聯合修復做出部分探索，證明其聯合體系具有良好的應用價值。