高通量測序揭示鈾污染對土壤真菌群落結構的影響

肖詩琦，宋 收，陳曉明，2*，戚 鑫，張祥輝，田 甲，黃 森，董發勤

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2.西南科技大學國防重點實驗室，四川 綿陽 621010）

隨著核電工業的快速發展，我國對天然鈾的需求量劇增。鈾礦冶煉和應用過程中，產生了大量含放射性鈾等重金屬的尾礦渣、尾礦水，使得土壤受到了放射性重金屬的污染[1-2]。土壤被鈾污染后，一方面具有放射性污染，通過放射性衰變產生射線穿透機體組織，損害細胞，另一方面，可通過呼吸系統或食物鏈等途徑進入人體，造成損害更大的內照射損傷，嚴重威脅人類身體健康[3-6]。因此，有必要考察鈾污染對土壤生態環境的影響。

土壤微生物在土壤生態系統中起著關鍵作用，80%～90%的土壤相關功能都被微生物所調節，包括土壤養分轉化，系統的穩定性及抗干擾能力等[7]。在生物學上微生物被認定為最敏感的土壤質量指標，其能直接反映污染物的毒性及潛在影響[8-10]。其中真菌構成了土壤的大部分微生物生物量，其具有分解有機質、為植物提供養分的功能，是生態系統健康的指示物[11]。此外真菌可通過不同機制對重金屬產生耐性，包括細胞外金屬吸附和沉淀、細胞內/胞外酶的產生、金屬與細胞壁的結合及細胞內的吸附和絡合等[12]。因此，對土壤真菌群落結構的研究能為評估和修復鈾污染生態環境提供一定的理論參考。

高通量測序具有高效、準確、信息量豐富等特點，已被廣泛應用于環境微生物群落研究中。Wu等[13]利用高通量測序技術，分析了電子污染回收區中土壤理化性質及重金屬對微生物群落組成和多樣性的影響，結果表明土地使用模式會改變微生物群落組成，并且汞是改變微生物群落多樣性最主要的因子。Guo等[14]利用高通量測序技術揭示了重金屬污染土壤中微生物群落的變化，并獲得重金屬敏感菌及耐性菌。這種技術為研究環境中微生物群落結構提供了大量的信息。基于此，本研究采用高通量測序研究了真菌群落組成及多樣性，比較不同鈾濃度處理后土壤真菌群落結構差異，為鈾污染土壤生態質量評估及修復提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及預處理

供試土壤采自西南科技大學校園內無污染、植被肥沃的暗棕壤，土壤基本理化性質見表1。采樣方法：在1 m2內采用5點法取樣，采樣時先鏟去地表植物，刮掉5 mm厚的表層土壤，挖取直徑為20 cm的土坑，取樣深度為6～10 cm。土壤采集后經過篩、去除雜質等前處理。土壤脅迫處理采取向供試土壤中添加外源鈾的形式，樣品采用培養皿進行培養，每個培養皿中25 g濕土。選用醋酸雙氧鈾[UO2（CH3COO2）2·2H2O，分析純，湖北楚勝威化工有限公司]，以純鈾計，配制成1 g·L-1鈾溶液并以其為母液進行脅迫處理。外源鈾脅迫濃度為2、5、10、20、50、100 mg·kg-1，依次記為U2、U5、U10、U20、U50和U100。以原始土壤作為空白對照，記為U0。處理后的土壤放置在25℃下進行培養，脅迫時間為15 d，土壤水分保持為田間持水量的60%。

表1 參試土壤基本理化性質Table 1 Basic physical and chemical properties of the soil

1.2 土壤DNA提取及高通量測序

采用OMEGA生物公司的E.Z.N.A.Soil DNA Kit抽提試劑盒提取土壤總DNA。擴增選取真菌18S rRNA基因中的ITS1F-ITS2區段作為擴增對象，采用引物：正向 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAG TAA-3′），反向 2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TG C-3′）。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXY?GEN公司）切膠回收PCR產物，將PCR產物用Quanti?FluorTM-ST藍色熒光定量系統進行檢測定量，根據測得的DNA濃度，將樣品按1∶1比例混合，并振蕩混合均勻。MiSeq文庫構建及Illumina高通量測序均由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。將測得序列上傳至NCBI數據庫中，獲得登錄號SRR6921796、SRR6921807、SRR6921809、SRR6921813、SRR6921814、SRR6921851和SRR6921858。

1.3 數據分析

多樣性數據分析：對測得所有序列進行OTU劃分，基于97%的相似性生成OTU表格，并構建稀釋曲線。應用Mothur軟件中的summary.single命令，計算Chao1、Ace、Shannon及Simpson 4種常用的生物多樣性指數。

分類學分析：使用Qiime平臺與RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析（置信度閾值為0.7），其中以Unite為數據庫，得到不同濃度鈾處理樣本的真菌在門和屬水平上的組成[15-16]。分類學數據庫中會出現一些分類學譜系中的中間等級沒有科學名稱，以norank作為標記。分類學比對后根據置信度閾值的篩選，會有某些分類譜系在某一分類級別分值較低，以Unclassified標記。

統計分析：采用SPSS 17.0中相關性分析考察鈾污染與真菌群落的關系。主成分分析（Principle com?ponent analysis）方法分析不同濃度鈾處理樣本間真菌群落的差異，采用R語言的Vegan包實現[17]。

2 結果與分析

2.1 土壤真菌多樣性指數

測序共得到有效reads 223 004條，平均每個樣品31 857條，其中平均堿基數高達7 771 584，平均片段長度為245 bp。采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建稀釋性曲線，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理。如圖1所示，6個處理組的稀釋性曲線先呈直線上升隨后均趨于平坦，更多的數據量只會產生少量新的OTU，說明樣本量足以覆蓋所有真菌。并且樣本測序深度指數值均在99%以上（表2），進一步證實本次測序結果能較好地代表樣本中微生物的真實情況。此外，還獲得不同樣本中真菌的Alpha多樣性指數值。Ace和Chao1指數均可用于估算群落中OTU的數目，兩種指數算法不同。該試驗中，U10、U50和U100處理組的Chao1和Ace指數較對照組高，而U2、U5和U20處理組的較對照組低，其中U20處理組的兩種指數均最低。Shannon和Simpson均表征微生物群落多樣性。Shannon值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson值越大，群落多樣性越低。其中U20處理組的Shannon值最低，為1.86；U50處理組的Shannon值最高，為2.45。除U20處理組外，其余鈾處理組多樣性均高于對照組，該結果表明了鈾處理對土壤真菌多樣性有重要影響，并且20 mg·kg-1的鈾處理對土壤真菌影響較大。

圖1 鈾處理下土壤真菌的稀釋性曲線Figure 1 Rarefaction curves of soil fungi under uranium stress

表2 鈾處理下土壤真菌的Alpha多樣性指數Table 2 Alpha index of soil fungi under uranium stress

2.2 土壤真菌群落組成

由圖2可知，檢測所得的OTU主要屬于4個門類，在整體水平接合菌門（Zygomycota，33.46%～73.36%）豐度最高，其次為子囊菌門（Ascomycota，24.56%～59.33%）、未被分類的真菌門Fungi_unclassi?fied（1.68%～7.86%）及擔子菌門（Basidiomycota，0.41%～3.53%）。與對照組相比，土壤在受到鈾脅迫后，接合菌門豐度下降，而子囊菌門豐度升高。與賀根和等[18]研究結果相似，子囊菌門在受到重金屬污染后豐度升高，表明子囊菌門真菌可能對重金屬具有較強的耐受性。此外，未分類真菌在土壤中占有一定比例，并且其在外源鈾脅迫后的土壤中比例更高，因此未知真菌在土壤響應鈾脅迫中具有重要意義。

圖2 鈾處理下土壤優勢真菌的相對豐度Figure 2 Relative abundance of dominant fungi under uranium stress

圖3 鈾處理下土壤真菌群落聚類熱圖Figure 3 Heatmap of fungal community clusters under uranium stress

在屬水平（圖3），獲得前100種優勢菌屬。豐度大于1%的菌屬有Mortierella、Ascomycota_unclassi?fied、Fungi_unclassified、Fusarium、Staphylotrichum、Basidiomycota_unclassified、 Montagnulaceae_unclassi?fied、Haematonectria、Podospora、Agaricales_unclassi?fied、Coniochaetaceae_unclassified、Pyrenochaetopsis和Entrophospora。其中Mortierella（33.46%～73.3%）和As?comycota_unclassified（15.89%～52.56%）顯著富集在各處理組中。與對照相比，鈾處理之后土壤中Mortierel?la的數量顯著下降，最多減少了40%；而Ascomyco?ta_unclassified明顯增加，最高增加了37%。

此外，在鈾處理后，部分優勢菌種消失，同時也出現新的物種。其中Mortierellales_unclassified，Lophiosto?ma，Xylaria和Thelonectria僅在對照組中檢測到，而Trichosporon和Agaricomycetes_unclassified僅出現在各鈾處理組中。某些菌屬僅在某一鈾處理組中檢測到，如Glomus，Fellomyces，Rhizoctonia，Scutellinia和Occultifur僅存在于U100處理組中，Myxotrichaceae_unclassified和Eurotiomycetes_unclassified僅存在于U50組中，而Westerdykella和Sporobolomyces僅存在于U10處理組中。以上結果表明，土壤在受到鈾污染后，其真菌群落組成有明顯的變化。

2.3 鈾污染對土壤真菌群落的影響

圖4 鈾處理下土壤真菌群落PCA分析Figure 4 PCA analysis of fungal communities under uranium stress

利用主成分分析（PCA）考察不同濃度鈾污染土壤中真菌群落結構的差異。從圖4可以看出，第一主坐標軸對樣品差異的貢獻值為88.55%，第二主坐標的貢獻值為7.72%。種類聚類中距離較近的樣本代表其真菌群落結構較為相似，其中U10和U50鈾處理樣品的真菌結構相似，U5和U100鈾處理樣品的真菌結構相似，而U0對照組土壤中真菌結構與鈾處理組相差較大。該結果表明了不同濃度的鈾污染對土壤中的真菌群落結構有明顯影響。

本研究采用相關性分析，進一步考察了鈾與優勢菌屬間的關系。分析結果顯示多數優勢菌屬與鈾無顯著關系，其中10種菌屬與鈾有顯著相關性，表明該10種真菌對鈾具有一定耐性。如表3所示，鈾與 Epicoccum、Agaricomycetes_unclassified和 Cylindro?carpon呈顯著相關（p＜0.05），與 Pseudeurotium、Glo?mu、Fellomyces、Rhizoctonia、Scutellinia、Occultifur和Cephaliophora呈極顯著正相關（p＜0.01）。

3 討論

本研究采用Illumina MiSeq測序技術，從真菌群落多樣性、組成及結構方面考察了不同濃度鈾污染對土壤微生物的影響。研究結果表明，不同濃度鈾處理后，土壤真菌群落豐度及多樣性均產生明顯變化。這可能是由于當微生物群落暴露于重金屬污染程度改變的環境時，對重金屬毒性敏感的微生物顯著減少，而耐性微生物能很快適應環境的變化[19]。此外，多數鈾處理組Shannon指數均高于對照組，表明鈾處理后真菌群落多樣性上升。與本研究相似，陳承利[20]發現重金屬污染使土壤中真菌增多，從而使其多樣性增加。而Jose等[21]研究發現高濃度重金屬污染會顯著降低細菌群落多樣性，這可能由于微生物對重金屬的響應程度不同，其中真菌對重金屬耐性最高，其次是細菌和放線菌。

在群落組成上，真菌主要以Mortierella和Ascomy?cota_unclassified為主。其中Mortierella在鈾處理后，豐度下降。該結果與楊金水等[22]對鉛鋅礦區中土壤優勢真菌的分析結果相似，Mortierella在低濃度重金屬污染樣品中豐度更高。同時，鈾脅迫后某些菌屬消失，也新增了部分菌屬。例如Xylaria僅在對照組中檢出而Trichosporon僅在鈾處理后出現。Fellomyces，Eurotiomycetes_unclassified和Sporobolomyces等僅存在于某一鈾處理組中。主成分分析結果表明，受到鈾處理后的土壤真菌群落結構更為相似。這些結果表明在鈾污染下，土壤真菌群落結構發生了變化。這可能是一定程度的鈾污染改變了原有群落內部種群之間的競爭關系，導致原始種群失去了優勢，而耐鈾微生物豐度增加并且某些微生物耐受鈾的過程產生的產物保護了其他種群的微生物，從而使鈾污染土壤的優勢種群發生了明顯改變[23]。

表3 與鈾具有顯著相關性的優勢菌屬Table 3 Significant correlation of dominant genera with uranium

本研究中獲得的對鈾具有耐性的真菌中Glomus、Rhizoctonia、Scutellinia、Agaricomycetes及 Cylindrocar?pon均為菌根真菌。該類真菌可與植物形成共生體系，是自然界普遍存在的微生物，其在鈾的固定和累積中起著一定的作用[24-25]。大量的研究證實[26-28]，在重金屬污染土壤中，菌根真菌一方面可以幫助植物吸收礦質養分促進其生長，從而增強植物對重金屬污染的耐受能力，另一方面菌根真菌自身能夠吸收、固持重金屬，從而在一定程度上降低土壤重金屬對植物的有效性和毒性[29-31]。鄭文君等[32]考察了接種Glomus sp.對蜈蚣草吸附鈾的影響。研究結果表明，接種該真菌有助于蜈蚣草吸附鈾并能減緩鈾對蜈蚣草的毒害。Vare[33]利用能量分散X射線考察了菌根真菌對重金屬的耐性機理，其在菌根真菌的液泡中發現有重金屬聚磷酸沉淀。其中磷酸根易與鈾螯合形成結晶體，并且其能主動吸收鈾并能在細胞內形成鈾的磷酸鹽沉淀[34]。本研究中真菌對鈾的耐性可能是由于鈾離子在進入細胞后被轉運至液泡，或者在胞質中與磷酸或其他易結合物質結合形成沉淀。其中鈾的磷酸沉淀能大幅降低細胞中可溶性鈾的濃度，從而使細胞免受進一步毒害。基于此，利用微生物對鈾的耐受性機制和環境行為的特點來修復受鈾污染的環境前景廣闊，進一步研究微生物的耐鈾機制有著重要的理論與實踐意義。

4 結論

（1）與對照組比較，鈾污染后真菌群落多樣性有明顯改變。鈾脅迫濃度為50 mg·kg-1時，土壤真菌多樣性最高，鈾脅迫濃度為20 mg·kg-1時，土壤真菌多樣性最低。

（2）鈾污染后土壤優勢種群發生明顯改變。與對照組比較，Mortierella豐度最多減少了40%；而Asco?mycota_unclassified最高增加了37%。主成分分析結果表明，鈾處理組土壤真菌群落結構均與對照組差異最大。

（3）相關性分析結果得到10種對鈾具有耐性的真菌，分別是 Pseudeurotium，Glomus，Agaricomycetes_unclassified，Epicoccum，Fellomyces，Rhizoctonia，Scutellinia，Occultifur，Cephaliophora和Cylindrocarpon。