一株DMP降解菌的分離鑒定及特性研究

徐偉慧，劉 帥，王志剛，2*

（1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農(nóng)業(yè)部華南都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640）

鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid ester，PAEs）又被稱作酞酸酯，是一種使用面廣，年產(chǎn)量大的人工合成有機(jī)化合物[1]。其常被用作增塑劑和軟化劑而添加到塑料用品之中，PAEs被證明具“三致”作用[2-3]。目前PAEs已廣泛存在于空氣、水體和土壤等環(huán)境介質(zhì)，并在動(dòng)植物體內(nèi)積累[4-5]，最終通過(guò)食物鏈危害人類的健康。

PAEs在環(huán)境中尤其是土壤環(huán)境中不易自然降解，因此利用微生物降解土壤環(huán)境中的PAEs已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。中國(guó)國(guó)家環(huán)境監(jiān)測(cè)中心將鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）和鄰苯二甲酸二辛酯（DNOP）3種PAEs確定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物[6-7]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)DMP可改變黑土土壤呼吸，影響土壤酶活性以及物質(zhì)的代謝，使黑土微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)和功能代謝菌群數(shù)量發(fā)生改變，微生物多樣性降低[8-9]，導(dǎo)致黑土生態(tài)系統(tǒng)功能受到影響。因此，尋找高效的DMP降解菌尤為重要。本研究以長(zhǎng)期覆蓋塑料廢棄物的垃圾場(chǎng)的土壤為試材，篩選能降解DMP的菌株并研究其特性，旨在分離降解DMP的優(yōu)勢(shì)菌種，為今后構(gòu)建具有高效降解性能的微生物體系及控制DMP污染和土壤生物修復(fù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基

微量元素儲(chǔ)備液：CaSO4·5H2O 4.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.0 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 7.0 g，CoCl3·6H2O 0.2 g，NaMO4·2H2O 3.4 g，CaCl22.0 g，H2O 1000 mL，pH 7.0。

基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽（MSM）培養(yǎng)基：K2HPO4·12H2O 1.0 g，KH2PO41.0 g，NH4Cl 0.8 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，微量元素儲(chǔ)備液2 mL，H2O 1000 mL。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，酵母粉 5.0 g，NaCl 10.0 g，H2O 1000 mL。

1.2 DMP降解菌的分離與鑒定

從長(zhǎng)期覆蓋塑料廢棄物的露天垃圾場(chǎng)中采集土樣，稱5 g土樣放于含有50 mg·L-1DMP的MSM培養(yǎng)液中進(jìn)行梯度壓力馴化培養(yǎng)，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速130 r·min-1的條件下培養(yǎng)3 d，取1 mL菌液接種到含有100 mg·L-1DMP的MSM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后從含有100 mg·L-1DMP的MSM培養(yǎng)基中取1 mL菌液接種到含有150 mg·L-1DMP的MSM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，以此步驟進(jìn)行培養(yǎng)，30 d后直至培養(yǎng)基中的DMP濃度達(dá)到500 mg·L-1，培養(yǎng)30 d后，取0.1 mL菌液稀釋涂布到固體MSM培養(yǎng)基平板中，30℃培養(yǎng)7 d。挑選不同菌落形態(tài)的單菌落接種到新鮮的MSM瓊脂板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。隨后重復(fù)劃線培養(yǎng)2～3次，在此期間用接種環(huán)挑取細(xì)菌進(jìn)行番紅染色，并利用光學(xué)顯微鏡制片觀察，直至分離的培養(yǎng)物為純培養(yǎng)物的單菌落，將分離純化得到的細(xì)菌接入LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后取菌液離心，棄上清，沉淀保存在-20℃的冰箱中備用。

16S rDNA序列分析：使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（編號(hào)：B518255）提取DNA。PCR擴(kuò)增 采 用 細(xì) 菌 通 用 引 物[10]，27f：（5′-AGAGTTT?GATCCT-GGCTCAG-3′）和 1492r：（5′-TACG?GCTACCTTGTTACG-ACTT-3′），由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系20 μL為：10×Ex Taq buffer 2.0 μL、2.5 Mm dNTP Mix 1.6 μL、5p 27f 0.8 μL、5p 1492r 0.8 μL、DNA 模板 0.5 μL、5u Ex Taq 0.2 μL、ddH2O 14.1 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，24個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，尋找與目的序列同源性最高的已知分類地位菌種的16S rDNA序列。采用MEGA 5.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 DMP降解菌生長(zhǎng)及降解的特性研究

將純菌株接種到150 mL含有500 mg·L-1DMP的MSM培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速130 r·min-1、溫度30℃的條件下培養(yǎng)3 d，每隔12 h測(cè)量菌液OD600，并取10 mL菌液離心，取上清用乙酸乙酯萃取，將上層有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，利用高效液相色譜測(cè)量培養(yǎng)基中剩余的DMP濃度。所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4 DMP降解菌對(duì)不同碳源的利用

將0.1 mL菌液分別接種到含有不同碳源為底物的MSM培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速130 r·min-1，溫度30℃的條件下培養(yǎng)3 d。根據(jù)菌株的生長(zhǎng)情況以及OD600的大小確定降解菌對(duì)不同碳源的利用能力。底物分別為DMP、DBP（鄰苯二甲酸二丁酯）、DEP、DEHP（鄰苯二甲酸二異辛酯）、PA（鄰苯二甲酸）、PCA（原兒茶酸）、蔗糖和葡萄糖。

1.5 不同溫度和pH對(duì)DMP降解菌生長(zhǎng)的影響

將菌株接種在MSM的液體培養(yǎng)基中（DMP 500 mg·L-1），30 ℃、130 r·min-1條件下活化培養(yǎng)36 h。取1 mL活化后的菌液接種到含有不同pH的MSM培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，以30 ℃、130 r·min-1條件培養(yǎng)3 d。每隔12 h取5 mL菌液測(cè)量OD600，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

將1 mL活化后的菌液接種到含有500 mg·L-1DMP的 MSM 培養(yǎng)基（pH7）中，分別在 25、27.5、30、32.5℃和35℃溫度下培養(yǎng)3 d。每隔12 h取5 mL菌液測(cè)量OD600，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 DMP降解菌降解DMP的動(dòng)力學(xué)方程及中間代謝產(chǎn)物研究

取1 mL活化后的菌液接種到含有不同初始DMP（100、200、300、400 mg·L-1和500 mg·L-1）濃度的MSM培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速130 r·min-1及最佳pH和溫度的條件下培養(yǎng)3 d（pH 8，30℃）。每隔12 h取10 mL培養(yǎng)液4000 r·min-1離心10 min，上清液用乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，高效液相色譜分析儀測(cè)量培養(yǎng)基中剩余的DMP濃度。利用液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析降解過(guò)程中所生成的中間代謝產(chǎn)物。動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算參考Chen等[11]的方法，曲線擬合動(dòng)力學(xué)分析采用Sig?ma Plot軟件，所有的測(cè)試均重復(fù)3次。

1.7 DMP降解菌降解基因的擴(kuò)增

使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（編號(hào)：B518255）從新培養(yǎng)的菌液中提取細(xì)菌DNA。根據(jù)Eaton[12]發(fā)現(xiàn)的降解基因序列設(shè)計(jì)引物，引物如表1所示。以降解菌DNA為模板分別在不同退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，跑瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，切取符合目的片段大小的PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序，核酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2013和Sigma Plot等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMP降解菌的分離與鑒定

本研究通過(guò)馴化、富集培養(yǎng)4周后成功從長(zhǎng)期覆蓋塑料廢棄物的垃圾場(chǎng)土壤中分離了一株DMP降解菌，將其命名為QD15-1，菌株QD15-1是一株好氧菌，在DMP為唯一碳源和能源的MSM平板上菌落形態(tài)呈現(xiàn)出不透明的乳黃色，菌落表面濕潤(rùn)，邊緣整齊如圖1a。

在光學(xué)顯微鏡下菌體為球狀，無(wú)芽孢，革蘭氏染色為陰性（圖1b）。生理生化指標(biāo)見表2，伏-普試驗(yàn)、油脂水解試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)等結(jié)果為陽(yáng)性，其余試驗(yàn)為陰性。

圖1 菌株QD15-1的菌落圖與顯微觀察Figure 1 Colony of strain QD15-1 and microscopic observation

表2 菌株QD15-1的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain QD15-1

表1 用于PCR分析的基因和引物Table 1 Genes and primers used in PCR analysis

根據(jù)16S rDNA的測(cè)序結(jié)果和GenBank中已登錄的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株QD15-1與Paracoccus sp.CY-b28（JX997853.1）等的同源相似度為100%，并采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建菌株QD15-1的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），基于菌株的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析，將菌株確定為Paracoccus sp.QD15-1。

2.2 DMP降解菌的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)DMP的降解效應(yīng)

菌株P(guān)aracoccus sp.QD15-1的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)DMP的降解情況如圖3所示。隨著菌株QD15-1吸光值（OD600）逐漸增高，培養(yǎng)基中的DMP含量下降。菌株QD15-1接種到培養(yǎng)基中12 h內(nèi)菌液的吸光值增長(zhǎng)很小，表明菌株QD15-1繁殖量少，此階段為菌株的適應(yīng)期，此時(shí)期內(nèi)DMP降解速率小。12～48 h是菌株QD15-1的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)期菌株QD15-1生長(zhǎng)迅速，菌液OD600增長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)基中DMP的濃度下降最為明顯，且下降到最低值。48～60 h，菌株QD15-1生長(zhǎng)進(jìn)入到穩(wěn)定期，此時(shí)期內(nèi)菌液的吸光值達(dá)到最高，OD600為1.64，并保持穩(wěn)定，表明培養(yǎng)基的菌體量已達(dá)到最大，此時(shí)培養(yǎng)基中DMP濃度略有上升。經(jīng)過(guò)60 h的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中DMP濃度從500 mg·L-1下降到50.16 mg·L-1，降解率為89.9%。

2.3 降解菌株QD15-1對(duì)不同碳源底物的利用

培養(yǎng)3 d后通過(guò)吸光值大小判斷菌株利用底物的能力，菌株QD15-1利用不同底物的情況如表3所示。菌株QD15-1能利用DMP、DBP、DEP、DEHP、PA和葡萄糖為唯一碳源和能源在MSM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但其不能利用PCA和蔗糖進(jìn)行生長(zhǎng)。

2.4 不同pH對(duì)菌株QD15-1生長(zhǎng)的影響

不同pH對(duì)菌株QD15-1生長(zhǎng)的影響如圖4所示。從圖4中可以看出，菌株QD15-1能夠在pH 6～9范圍內(nèi)生長(zhǎng)，在pH 5條件下，菌株QD15-1不能正常生長(zhǎng)；在pH 7和pH 8條件下，菌株QD15-1進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間要早于pH 9，且在pH 7和pH 8條件下，菌株QD15-1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增長(zhǎng)率十分接近，在pH 8的條件下菌液OD600最大，因此，以DMP為唯一碳源，菌株QD15-1生長(zhǎng)最適pH為8。

表3 菌株QD15-1利用底物的試驗(yàn)Table 3 The test of strains QD15-1 using the substrate

圖2 基于QD15-1和相關(guān)菌株的16S rDNA序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Established phylogenetic tree by neighbor-joining method，based on 16S rDNA sequences of QD15-1 and the related strains

圖4 不同pH對(duì)菌株QD15-1生長(zhǎng)的影響Figure 4 The effect of different pH on strain QD15-1 growth

2.5 不同溫度對(duì)菌株QD15-1生長(zhǎng)的影響

從圖5中可以看出，菌株QD15-1能夠在25～35℃這個(gè)范圍內(nèi)生長(zhǎng)，培養(yǎng)12 h后菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在25℃下菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD600最低，35℃條件下菌株生長(zhǎng)速率先慢后快，30℃條件下菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD600最高，表明在30℃時(shí)菌株QD15-1的生長(zhǎng)速度最快。因此，以DMP為唯一碳源，菌株QD15-1最適生長(zhǎng)溫度為30℃。

2.6 菌株QD15-1降解DMP的動(dòng)力學(xué)方程

如圖6所示，培養(yǎng)60 h后菌株QD15-1可降解大部分DMP，降解率隨著初始DMP濃度的升高（100、200、300、400、500 mg·L-1）而增高，分別為 80.0%、89.0%、89.6%、91.7%和97.0%。同時(shí)菌株QD15-1降解DMP符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程：

式中：C為DMP隨著時(shí)間增長(zhǎng)的剩余濃度，t為培養(yǎng)時(shí)間，K為一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，A表示常數(shù)。DMP生物降解的半衰期可以根據(jù)下面方程計(jì)算：

圖5 不同溫度對(duì)菌株QD15-1生長(zhǎng)的影響Figure 5 The effect of different temperature on growth of strain QD15-1

圖6 不同初始DMP濃度對(duì)菌株QD15-1降解能力的影響Figure 6 The effect of different initial concentrations of DMP ondegradation ability of strain QD15-1

表4顯示降解菌QD15-1在不同初始DMP濃度（100～500 mg·L-1）下的降解動(dòng)力學(xué)方程。DMP生物降解過(guò)程符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程（R2＞0.9）。隨著DMP濃度的增加，其半衰期相應(yīng)地縮短，從2.17 d縮短到0.84 d。

2.7 降解基因的確認(rèn)

從QD15-1的基因組中擴(kuò)增出2個(gè)降解基因，測(cè)序結(jié)果顯示，一個(gè)基因的長(zhǎng)度為577 bp，此基因序列與Arthrobacter keyseri 12B中發(fā)現(xiàn)的鄰苯二甲酸酯雙加氧酶基因小亞基的同源相似度高達(dá)92%，該基因在Genbank的名稱及登錄號(hào)為：PAphtAb（MH040800）。另一個(gè)基因的基因長(zhǎng)度為1008 bp，此基因序列與Ar?throbacter keyseri 12B中發(fā)現(xiàn)的3，4-二羥基-3，4二氫鄰苯二甲酸脫氫酶的同源相似度為88%，該基因在Genbank的名稱及登錄號(hào)為：PAphtB（MH040801）。

2.8 中間代謝產(chǎn)物的確認(rèn)及代謝途徑的推測(cè)

從圖7a中可看出，DMP的峰值在色譜圖中保留的時(shí)間為3.50 min，在光譜上其離子特征峰為163。圖7 b中顯示PA的峰值在色譜圖中保留的時(shí)間為0.81 min，在光譜上其離子特征峰為149。圖7c顯示PCA的峰值在色譜圖上保留的時(shí)間為1.26 min，其在光譜上離子特征峰為109和153。從圖8中可以看出，接入降解菌QD15-1培養(yǎng)3 d后，在色譜圖中有1個(gè)峰明顯升高，保留時(shí)間為1.62 min，其離子特征峰為149和163，由此可知，DMP可能生成了鄰苯二甲酸單酯；而未接入降解菌株QD15-1的在1.62 min處也有一個(gè)微小的峰，表明DMP可在常溫條件下水解形成鄰苯二甲酸單酯，但降解速度很慢。同時(shí)，在圖8b中還出現(xiàn)了2個(gè)新的峰，保留時(shí)間分別為0.63 min和5.0 min，其中保留時(shí)間為0.63 min，峰的光譜特征很亂，暫時(shí)不能確定其是什么物質(zhì)，而保留時(shí)間為5.0 min，峰的光譜特征峰為149，與PA的特征峰吻合，說(shuō)明培養(yǎng)基中有PA生成。因此，聯(lián)系之前降解基因擴(kuò)增的結(jié)果，可推測(cè)DMP在降解菌的作用下首先水解生成鄰苯二甲酸單酯，然后再轉(zhuǎn)化成PA，在鄰苯二甲酸雙加氧酶基因（PAphtAb）和3，4-二羥基-3，4-二氫鄰苯二甲酸脫氫酶基因（PAphtB）的作用下進(jìn)一步降解。

表4 菌株QD15-1對(duì)不同初始濃度DMP生物降解的動(dòng)力學(xué)方程Table 4 DMP degradation kinetics equation in different initial concentration by strain QD15-1

圖7 標(biāo)準(zhǔn)物DMP（a）、PA（b）和PCA（c）的色譜圖和光譜圖Figure 7 Standard DMP（a），PA（b）and PCA（c）chromatograms and spectra

3 討論

圖8 未接入降解菌QD15-1（a）和接入降解菌QD15-1（b）培養(yǎng)3 d后的色譜圖Figure 8 The chromatograms of 3 days non-inoculation strain（a）and after inoculation degrading strain QD15-1（b）

本研究成功分離了一株能利用DMP作為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，經(jīng)鑒定為Paracoccus sp.QD15-1，好氧，革蘭氏陰性。近年來(lái)，關(guān)于Paracoccus sp.降解污染物的研究報(bào)道很多，如噬氨副球菌HPD-2能夠明顯提高土壤中多環(huán)芳烴的降解率[13]。張永樂等[14]分離了一株用于溴苯腈降解的副球菌MXX-04，能夠以溴苯腈為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，降解率為95.3%。本研究中菌株P(guān)aracoccus sp.QD15-1能將培養(yǎng)基中濃度為 500 mg·kg-1的 DMP降解到50.16 mg·kg-1，降解率為89.9%。底物廣譜性利用實(shí)驗(yàn)表明，該菌株能利用DMP、DBP、DEP和DEHP等，與陳湖星等[15]研究結(jié)果類似，其篩選出的不動(dòng)桿菌HS-B1能分別以BBP、DMP、DEP、DBP、DEHP 等 PAEs類化合物為唯一碳源在MSM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。Zhang等[16]從河底泥中篩選出能以PAEs為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株Sphingomonas sp.XJ1。金雷等[17]在長(zhǎng)期受垃圾污染的土壤中篩選到一株DBP降解菌，該菌株在含有初始濃度為100 mg·L-1的DBP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)5 d可降解大部分DBP，降解率可達(dá)到82.7%。Wu等[18]分離鑒定的DBP降解菌可降解DBP最大為濃度400 mg·L-1，在48 h內(nèi)降解率達(dá)96%，但沒有報(bào)道該菌株降解其他PAEs的能力。本研究篩選的菌株P(guān)aracoccus sp.QD15-1是一株高效降解DMP的菌株，隨著初始DMP濃度（100、200、300、400、500 mg·L-1）的升高，降解率升高，降解率分別為80.0%、89.0%、89.6%、91.7%和97.0%，可能原因是隨著碳源的增多，菌株生長(zhǎng)繁殖較快，導(dǎo)致降解率提高。

菌株P(guān)aracoccus sp.QD15-1生長(zhǎng)的pH范圍是6～9，溫度范圍是25～35℃，最適宜生長(zhǎng)條件為初始pH 8.0，溫度30℃。該菌株與已發(fā)現(xiàn)的PAEs降解菌Pae?nibacillus sp.S-3[19]相比，能更好地適應(yīng)堿性環(huán)境，在修復(fù)堿性環(huán)境中DMP污染時(shí)具有優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)隨著DMP的降解，搖瓶?jī)?nèi)pH會(huì)發(fā)生變化，培養(yǎng)3 d后，初始pH值為5到9的搖瓶?jī)?nèi)pH會(huì)降低，可能原因是底物DMP在菌株的作用下被快速降解生成鄰苯二甲酸，之后鄰苯二甲酸的生成量不再增加，pH也隨之穩(wěn)定。而初始pH為5的搖瓶pH有所下降，但變化不大，可能與菌株不能在酸性條件下生長(zhǎng)，鄰苯二甲酸生成量小有關(guān)。李魁曉等[20]研究DMP生物降解的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。

菌株P(guān)aracoccus sp.QD15-1降解DMP符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程，Chen等[11]分離鑒定的DBP降解菌Camelimonas sp.M11同樣符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程。Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)DBP降解菌Providencia sp.2D降解DBP的過(guò)程也符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，不同的是該菌株降解DBP的半衰期隨著初始DBP濃度的升高而增長(zhǎng)，初始濃度從50 mg·kg-1到1000 mg·kg-1，其半衰期從8.66 h增長(zhǎng)到了26.16 h。本研究中菌株P(guān)aracoc?cus sp.QD15-1降解DMP半衰期的數(shù)值隨著DMP濃度的增加而縮短，從2.17 d縮短到0.84 d，可能與初始DMP濃度的升高降解率升高有關(guān)，說(shuō)明高濃度的DMP對(duì)菌株P(guān)aracoccus sp.QD15-1的降解無(wú)抑制作用。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[22-24]，目前研究比較成熟的有兩種降解途徑，分別是細(xì)菌（G+）降解途徑和細(xì)菌（G-）降解途徑，這兩種途徑的第一步降解大致相同，都是通過(guò)PAEs的自然水解或者在酯酶的作用下進(jìn)行水解形成鄰苯二甲酸，再經(jīng)過(guò)雙加氧酶等一系列的酶作用生成原兒茶酚，再經(jīng)一些酶的作用將苯環(huán)打開，最后逐步降解，最終生成水和二氧化碳。這兩種途徑不同的是涉及到的降解基因不同，其中革蘭氏陽(yáng)性菌的降解基因是3，4雙加氧酶基因（phtA）和3，4-二羥基-3，4-二氫鄰苯二甲酸脫氫酶（phtB），而革蘭氏陰性菌通過(guò)鄰苯二甲酸4，5雙加氧酶（ophA）和4，5-二羥基-4，5-二氫鄰苯二甲酸脫氫酶（ophB）[25-26]。為了研究Para?coccus sp.QD 15-1降解DMP的途徑，本研究從基因和中間代謝產(chǎn)物兩方面對(duì)該菌株進(jìn)行了研究。因菌株P(guān)aracoccus sp.QD 15-1為革蘭氏陰性菌，實(shí)驗(yàn)首先選擇革蘭氏陰性菌降解途徑中所參與的基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，遺憾的是經(jīng)過(guò)反復(fù)多次PCR都得不到目的基因條帶，隨后本實(shí)驗(yàn)又根據(jù)革蘭氏陽(yáng)性菌降解途徑中所參與的基因設(shè)計(jì)了引物并進(jìn)行PCR，有趣的是，PCR實(shí)驗(yàn)成功得到了2條和目的基因大小相同的條帶，后經(jīng)過(guò)純化、測(cè)序分析和BLAST比對(duì)，顯示這兩個(gè)條帶為實(shí)驗(yàn)想要得到目的基因——鄰苯二甲酸酯雙加氧酶基因小亞基（PAphtAb）和3，4-二羥基-3，4-二氫鄰苯二甲酸脫氫酶（PAphtB），這兩個(gè)基因與Arthrobacterkeyseri 12B[12]上的降解基因的同源性分別為92%和88%。為什么革蘭氏陰性菌中會(huì)有革蘭氏陽(yáng)性菌的基因，經(jīng)過(guò)分析，推斷可能是基因片段和質(zhì)粒在微生物之間發(fā)生了水平轉(zhuǎn)移。水平轉(zhuǎn)移是指某些基因如本實(shí)驗(yàn)的降解基因通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等途徑在細(xì)菌和細(xì)菌之間、環(huán)境和細(xì)菌之間、病毒和細(xì)菌之間傳播，最終使得更多細(xì)菌獲得降解功能[27]。基因的水平轉(zhuǎn)移和基因的傳播突破了生物遺傳的種屬保守限制，基因可在同種屬細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移，也可以在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)菌如革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌之間傳播[28]。因此，本研究分離得到DMP降解菌Paracoccus sp.QD 15-1為革蘭氏陰性，可能通過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移得到了革蘭氏陽(yáng)性菌的基因片段并整合到了自己的基因組中，從而使自己獲得了降解PAEs的能力。

利用高效液相質(zhì)譜對(duì)降解菌Paracoccus sp.QD 15-1的中間代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在培養(yǎng)3 d后搖瓶中出現(xiàn)了新物質(zhì)，分別為鄰苯二甲酸單酯和鄰苯二甲酸，表明DMP在降解菌的作用下首先水解生成鄰苯二甲酸單酯，然后再轉(zhuǎn)化成鄰苯二甲酸，這與Eaton[12]的研究發(fā)現(xiàn)PAEs在酯酶的作用下直接生成鄰苯二甲酸的結(jié)果有所不同，推斷可能是該菌株的基因組中沒有能夠讓PAEs快速水解的酯酶，而且這與PCR的結(jié)果也相互對(duì)應(yīng)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)Paracoc?cus sp.QD 15-1的降解中間產(chǎn)物中沒有原兒茶酸生成，這個(gè)結(jié)果恰好與降解基因的研究結(jié)果相一致，由于該菌株的降解基因中正好缺少了一個(gè)脫羧酶（phtC），所以導(dǎo)致PAEs只能降解到鄰苯二甲酸而無(wú)法生成原兒茶酸。因此，推測(cè)該菌株可能還有其他降解途徑，或者不能將PAEs完全降解為水和二氧化碳。

4 結(jié)論

（1）從長(zhǎng)期覆蓋塑料廢棄物的垃圾場(chǎng)土壤中分離到一株以DMP為唯一碳源的菌株，經(jīng)鑒定該菌株為副球菌屬，命名為Paracoccus sp.QD15-1，革蘭氏陰性，該菌株能降解多種PAEs。

（2）以DMP為唯一碳源，菌株P(guān)aracoccus sp.QD15-1生長(zhǎng)的最適條件為pH 8，溫度30℃；該菌株是一株高效降解DMP的菌株，降解DMP過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，隨著DMP初始濃度的增加，半衰期縮短。

（3）該菌株中含有2個(gè)降解PAEs的基因PAphtAb和PAphtB，推測(cè)其降解途徑為：DMP降解為鄰苯二甲酸單酯，其再分解為鄰苯二甲酸，通過(guò)PAphtAb和PAphtB的作用進(jìn)一步降解。