雞DIO2基因的克隆與生物信息分析

李笑，陳燁，付強，張配穎，牛文曉，黃天成

（河北農業大學動物科技學院，河北保定071000）

正常體溫在維持動物機體內環境恒定和各項生理功能的正常活動中具有極其重要的作用[1]。飲食后的產熱作用（即食后體增熱）和冷應激導致的非顫抖產熱（Non-Shivering Thermogenesis,NST）作用是禽類主要的兩種產熱類型[2]。在恒溫動物體內，甲狀腺激素對于能量消耗、生熱、進化和生長等生物學功能起主要調節作用。在寒冷條件下，甲狀腺素分泌增加，促進糖和脂肪在機體內的分解以增加產熱，動物機體處在嚴熱條件下，就會降低甲狀腺素的功能，基礎代謝水平降低，以減少熱的產生[3]。存在于血液中的酪氨酸碘化物四碘甲腺原氨酸（Tetraiodothyronine,T4）和組織中有生物活性的三碘甲腺原氨酸（Triiodothyronine,T3）是甲狀腺激素的主要組成部分，DIO2能夠催化無活性的T4轉變為有活性的T3，是催化不同活性甲狀腺激素相互轉化的關鍵酶[4]。在冷應激的條件下，甲狀腺功能衰退,動物肌肉中DIO2的活性增加，這表明在寒冷條件下,DIO2在骨骼肌中具有很重要的作用。然而對禽類低溫調節機制研究還不是很清楚。DIO2基因主要在嚙齒類動物的下丘腦中表達，在甲狀腺、腹部脂肪也有表達；另外在綿羊、鳥類、魚類的下丘腦組織中也有表達，由此可見DIO2基因在不同物種多個組織中均有表達。本研究對雞DIO2基因進行克隆，確定了該基因在肌肉中的表達，并對其進行了生物信息分析，旨在為進一步研究DIO2基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集壩上長尾雞的肌肉組織，液氮速凍后于-70 ℃冰箱保存。

1.2 試劑與儀器

TransZol Up RNA提取試劑盒、TransScript Onestep gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒；TransStart Taq DNA Polymerase均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 引物設計

從Ensemble數據庫下載雞DIO2基因序列（Gallus gallus-5.0 Chr 5:40,594,965-40,606,615），以 該 序列作為模板，利用在線工具PRIMER3進行引物設計，PCR擴增長度為1400bp。擴增引物：正引物為5＇-GAATTCATCCGGCAGAAGAG-3＇，反引物為5＇-CACACCACCAGCACATTTTC-3＇。引物由北京華大基因科技公司合成。

1.4 總RNA提取與cDNA反轉錄

使用TransZol法提取雞肌肉的總RNA，經質量檢測后置于-70℃保存備用。反轉錄反應體系：總 RNA1μg，Anchored Oligo(dt) Primer(0.5μg/μL)1μL，2×TS Reaction Mix10μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix1μL，gDNARemover1μL，RNasefree Water補充到20μL。將組織總RNA、Anchored Oligo(dt) Primer與無RNA酶的水溫和混勻，65 ℃靜置5min，冰浴2min，然后再加入其他反應組分。反轉錄反應條件：42 ℃靜置15min，85 ℃加熱5s失活TransScript RT/RI與 gDNA Remover，4 ℃保存。

1.5 DIO2基因擴增與檢測

DIO2基因擴增反應體系（20μL）：模板1μL，10×TransStartTaq Buffer(+Mg2+)2μL，正 反 向 引物各 1μL（濃度10 mM），2.5mM dNTPs 1.6μL，TransStartTaq Polymerase0.4μL（2.5U），用ddH2O補至20μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3min；94 ℃變性30s，57 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，共設40個循環；72 ℃擴增10min；4 ℃保存。用1%瓊脂糖凝膠進行檢測后送華大基因測序。

1.6 生物信息學分析

用BLAST程序對所測定的結果進行同源序列比對；用MEGA5.0的軟件進行分子進化樹的構建；用BioEdit軟件分析DIO2編碼的不同物種的氨基酸。

2 結果與分析

2.1 雞DIO2基因的克隆

通過Trizol法提取的雞肌肉組織的RNA，電泳后可看到清晰的18S和28S兩條條帶，說明所提取的RNA質量較好，可以用于下一步的反轉錄實驗。經RT-PCR擴增后獲得片段大小為1400bp的條帶（見圖1）。

圖1 肌肉DIO2基因PCR產物電泳圖

2.2 雞DIO2基因序列分析

將擴增出來的PCR產物送去華大基因測序，應用BLAST程序對測序結果與數據庫比對。測序結果顯示，克隆的雞肌肉組織的DIO2基因序列與數據庫中的DIO2基因序列（序列號：NP_989445）存在差異（黑色下劃線處）。將所克隆出來的基因序列與Ensembl數據庫中雞DIO2基因（序列號：ENSGALT00000044669.2）同源性進行比較，發現其相似性為99%，表明成功克隆出DIO2基因。

2.3 雞DIO2基因系統進化樹的構建

選擇壩上長尾雞與原雞（NP_989445.2）、火雞（XP_003206693.3）、朱鹮（XP_009475507.1）、暴風鹱（XP_009573608.1）、波斑鴇（XP_010125525.1）、卷羽鵜鶘（XP_009491378.1）、紅喉潛鳥（XP_009510468.1）、白鷺（XP_009806638.1）鴕鳥（XP_015720714.1）、普通鸕鶿（XP_009644932.1）、日本鵪鶉（XP_009668786.1）和濱鷸（XP_014797434.1）等進行了多重序列比較，結果見圖3。由圖3可知，DIO2基因在不同物種中具有較高的保守性。應用MEGA5.0軟件構建系統進化樹，結果見圖4。由圖4可知，壩上長尾雞與日本鵪鶉的相應序列聚為一支，進化樹在分類學與形態方面一致性較高，說明成功克隆了雞的DIO2基因。

圖2 肌肉DIO2基因與數據庫BLAST結果圖

圖3 雞與其他物種DIO2氨基酸序列多重比對

圖4 雞與其他物種DIO2的系統進化樹

3 討論

本研究根據從Ensembl數據庫下載的雞DIO2基因序列，并且以該序列為模板，采用在線工具Primer3.0對引物進行設計，成功克隆出壩上長尾雞總長為1039bp的DIO2基因序列的一部分，此序列包括完整的編碼區840bp，共編碼279個氨基酸，通過序列分析結果表明雞DIO2基因在不同物種之間具有很高的保守性。由生物信息學的方法對DIO2蛋白的二級結構進行預測分析，得到氨基酸的核心組成。

DIO2作為動物體內重要的平衡體溫因子，在低溫條件下對于動物體溫的調節有著重要作用，對其分子結構和功能的研究已成為目前研究的熱點。由于骨骼肌的生熱能力克服了褐色脂肪組織（BAT）生熱的缺乏，所以敲除解耦聯蛋白1基因的小鼠，在寒冷條件依然是存活的。此外，在甲狀腺功能衰退的動物中其骨骼肌和紅肌在冷應激4小時后DIO2活性上調，表明T3的局部生成在骨骼肌處于冷應激環境中發揮重要的作用。在生物體逐漸適應冷應激環境的過程中，T3在骨骼肌的生熱期起著至關重要的作用。經證明DIO2的活性在慢肌處于冷應激3天后發揮作用，在快肌處于冷應激10天后發揮作用，并且伴隨著耗氧量增加以及T3靶基因在快肌和慢肌兩種組織中的表達。即使在4 ℃下10天后，血清T3的濃度也保持不變，BAT和慢收縮肌肉DIO2已經正?；瘯r，快肌中DIO2活動在這種適應條件下對循環T3有明顯的促進作用。但以前在雞的肌肉中并沒有研究，在本次試驗中，選取了壩上長尾雞的肌肉組織進行RNA提取并進行了RT-PCR及DIO2基因克隆，結果顯示，DIO2基因在雞的肌肉中是表達的，為研究其在骨骼肌中參與體溫調節機制提供了依據。

通過對不同物種的DIO2基因構建系統進化樹，發現壩上長尾雞與日本鵪鶉遺傳距離最近，并且各個物種間的DIO2氨基酸序列差別不大，所以DIO2基因序列是保守的。本實驗中所選取的不同物種均屬于鳥類，它們具有相同的進化起源，遺傳進化距離較近，這可能是造成壩上長尾雞與日本鵪鶉遺傳距離最近的原因之一；而且本實驗中獲得的DIO2基因序列表明，其與不同物種的DIO2基因均具有較高的同源性，這可能也是造成壩上長尾雞與日本鵪鶉遺傳距離最近的原因之一。另外，本次試驗只選取了肌肉組織較為單一，對DIO2基因的功能研究還并不透徹，DIO2在不同組織中的表達情況以及分子調控機制仍然需要進一步的研究。

4 結論

在壩上長尾雞的肌肉組織中成功克隆出DIO2基因，編碼區全長1039bp，與Ensembl數據庫中的雞的DIO2基因同源性為99%，共編碼279個氨基酸，其中亮氨酸含量最高（12.5%）；聚類進化樹結果表明，不同物種的DIO2基因與雞DIO2基因在脫氧核苷酸序列和氨基酸序列都表現出高度的保守性；進一步證明DIO2序列的保守性較高。