基于人工神經網絡的L-天冬酰胺酶發酵培養基優化

王云龍，劉松*，堵國成，陳堅

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

L-天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1，L-Asparaginase，L-ASNase)是一種酰胺基水解酶，可以將天冬酰胺脫氨基生成天冬氨酸和氨[1]。該酶具有抗腫瘤活性，已被用于治療淋巴系統惡性腫瘤、兒童急性淋巴細胞白血病、網狀細胞肉瘤及霍金森病等疾病[2]。最新報道顯示，該酶也可用于油炸食品中以減少丙烯酰胺的生成[3-4]。由于L-ASNase在食品與醫藥領域中的重要應用，已引起國內外廣大學者的極大興趣。

L-ASNase廣泛存在于動植物及微生物中[5]。但是由于動植物中L-ASNase含量少，分離提取困難，而微生物發酵法具有培養簡單、提取純化簡便以及易于大規模生產等優點，已成為商品化L-ASNase的主要來源[6]。由于野生菌發酵L-ASNase產量往往較低[7-8]，應用重組菌發酵成為提高L-ASNase產量的重要途徑[9-11]。KHUSHOO[12]等通過控制重組菌E.coliBLR(DE3)比生長速率并優化誘導劑添加時間，L-ASNase酶活在2 L發酵罐水平達到870 U/mL，其搖瓶水平L-ASNase產量為30.67 U/mL。龍水清[13]通過補料和溶氧控制策略將B.subtilis168L-ASNase的最終產量在5 L發酵罐水平提高到112.61 U/mL。SUSHMA[14]等通過培養基優化和持續誘導策略使B.subtilisWB800NL-ASNase產量在3 L發酵罐水平達到525.98 U/mL，其搖瓶水平為381.4 U/mL。

培養基是重組菌株生長和產物合成的基礎，優化培養基組成對重組L-ASNase生產具有重要意義。目前，一系列試驗設計方法和算法應用于培養基優化。KRISHNAN等[15]通過Plackett-Burman實驗優化乳酸菌產乳酸培養基，轉化率提高了30%。LI等[16]通過響應面優化培養基使吩嗪-1-羧酸產量提高3倍。WU等[17]通過人工神經網絡-遺傳算法模型使核黃素的產量提高了76.4%。其中，人工神經網絡是模仿人腦處理情報方式的100%黑箱性質的模型，對于高度非線性且含有噪聲的生物系統非常適用[18]。

本研究以研究室前期構建的菌株Bacillussubtilis/ASNΔ25/B2為生產菌株[11]，通過單因素實驗、Plackett-Burman實驗、最陡爬坡實驗、中心組合實驗和神經網絡模型對B.subtilis/ASNΔ25/B2產L-ASNase發酵培養基進行優化，以充分發揮菌株生產性能，提高L-ASNase產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：B.subtilis/ASNΔ25/B2[11]，由江南大學生物系統與生物加工工程研究室構建并保藏。

試劑：酵母粉，胰蛋白胨,英國Oxoid公司，BR;安琪酵母蛋白胨FP103，安琪胰蛋白胨FP318,安琪酵母股份有限公司，BR，安琪胰蛋白胨FP319,安琪酵母股份有限公司，BR;思賓格酵母蛋白胨，思賓格0805酵母浸粉，思賓格0806酵母浸粉,廣州一品鮮生物科技有限公司;L-天冬酰胺,美國Sigma-Aldrich公司；其他常用試劑均為國藥集團化學試劑有限公司分析純。

卡那平板培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，瓊脂20，硫酸卡那霉素0.05。

種子培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，硫酸卡那霉素0.05。

初始發酵培養基(g/L)：蔗糖35，胰蛋白胨20，尿素0.8，玉米漿8，K2HPO4·3H2O 3.26，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 1.8，NaCl 3，L-天冬酰胺1.2。初始pH 7.5。

優化發酵培養基(g/L)：蔗糖65，酵母蛋白胨28，玉米漿11，KH2PO411.5，NaCl 3.3，(NH4)2SO44，K2HPO4·3H2O 22.5，MgSO4·7H2O 1，L-天冬酰胺2。初始pH 7.5。

1.2 儀器與設備

XWY-240恒溫搖床,上海智誠儀器有限公司；臺式高速離心機,德國eppendorf公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計,日本Shimadzu公司；pH計,瑞士Mettler公司。

1.3 方法

1.3.1 種子活化

取適量保存在冷凍甘油管中的菌液涂布至卡那平板上，37 ℃培養過夜。

1.3.2 種子培養

將活化好的種子接種至裝有60 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，添加60 μL的50 mg/mL硫酸卡那霉素，搖床溫度37 ℃，轉速220 r/min，培養8～10 h。

1.3.3 搖瓶發酵培養

按4%的接種量將種子培養基接入裝有25 mL發酵培養基的250 mL搖瓶中，溫度37 ℃，轉速220 r/min。

1.4 實驗設計

1.4.1 Plackett-Burman 實驗設計

在單因素實驗的基礎上使用Design-Expert.V 8.0.6進行N=12的Plackett-Burman實驗設計和結果分析[19]，對發酵培養基中的9種成分進行研究。每個因素取高(+1)、低(-1)兩個水平，2個虛擬變量用來估計實驗誤差，以酶活為響應值。各組分及其水平設置如表1所示。

表1 Plackett-Burman實驗設計中變量的真實值Table 1 Real values of variables in Plackett-Burman experimental design

1.4.2 最陡爬坡實驗

根據Plackett-Burman實驗結果，綜合考慮各因素效應正負和原料成本來確定最陡爬坡實驗中各因素水平。

1.4.3 中心組合實驗

以最陡爬坡實驗的最優條件為水平中心，使用Design-Expert.V8.0.6進行5因素5水平的中心組合實驗(簡稱CCD實驗)[19]，如表2所示。

表2 CCD實驗中的變量和水平Table 2 Variable and its level in CCD design

1.4.4 神經網絡模型

使用JMP10.0以CCD實驗結果作為訓練和驗證數據樣本，選擇“K重”交叉驗證的方法執行模型啟動。設置合適的折數和隱藏節點數，過擬合罰項0.001，歷程數20，最大迭代數50，收斂準則0.000 01。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體濃度的測定

采用濁度法測定。取適量發酵液稀釋到適當倍數后使用紫外分光光度計于波長600 nm下測定吸光度，即OD600值。

1.5.2L-ASNase粗酶液制備

取一定量的發酵液于12 000 r/min離心10 min，上清液即為L-ASNase粗酶液。

1.5.3L-ASNase酶活測定

采用奈氏試劑法[11]。取900 μL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液，pH 7.5)加入200 μL底物(L-天冬酰胺，0.15 mol/L)于37 ℃保溫10～20 min后，加入100 μL稀釋到適當倍數的L-ASNase粗酶液，37 ℃反應10 min后加入100 μL終止劑(三氯乙酸，1.5 mol/L)終止反應，對照組在保溫前即加入終止劑。反應結束后于12 000 r/min離心2 min，取100 μL上清，加入3 400 μL去離子水和500 μL奈氏試劑，混勻后在波長436 nm下測定吸光度。

酶活力單位定義：37 ℃每分鐘水解L-天冬酰胺生成1 μmol氨所需要的酶量定義為1個L-ASNase活力單位。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 蔗糖質量濃度對L-ASNase酶活的影響

賈明媚[20]、陳璇[21]、SUSHMA[14]研究結果表明，蔗糖是B.subtilis合成L-ASNase的最適碳源。碳源濃度對菌體生長和產酶有較大的影響[21]。對初始培養基中的蔗糖質量濃度進行優化，結果如圖1所示。隨著蔗糖質量濃度的增加，菌體量和L-ASNase產量持續提高。在蔗糖50 g/L時，L-ASNase產量達到最大值，繼續增加蔗糖質量濃度雖然有利于菌體生長，但不利于產酶。

圖1 蔗糖質量濃度對L-ASNase酶活的影響Fig.1 Effect of sucrose concentration on L-ASNase activity

2.1.2 氮源對L-ASNase酶活的影響

在優化了蔗糖質量濃度的基礎上，添加相同質量的不同有機氮源替換初始培養基中的胰蛋白胨，結果如圖2所示。思賓格酵母蛋白胨和胰蛋白胨效果較好且接近，而酵母蛋白胨價格要遠遠低于胰蛋白胨，故選擇酵母蛋白胨做進一步研究。酵母蛋白胨質量濃度對L-ASNase酶活的影響如圖2-B所示，隨著酵母蛋白胨濃度的增加，菌體量和酶活一直在增加。

圖2 有機氮源對L-ASNase酶活的影響Fig.2 Effect of organic nitrogen on L-ASNase activity

圖3 無機氮源對L-ASNase酶活的影響Fig.3 Effects of inorganic nitrogen sources on L-ASNase activity

2.2 Plackett-Burman實驗

Plackett-Burman實驗是一種從多個因素中篩選出對實驗結果有顯著影響的因素的實驗方法[19]，可以用最少的試驗次數使因素的主效果得到盡可能精確估計。在單因素實驗確定的因素水平的基礎上，按照表1對發酵培養基中9種組分進行考察，以篩選出對酶活影響顯著的因素作進一步優化。Plackett-Burman實驗結果及方差分析如表3和表4所示。

表3 Placket-Burman實驗設計及對應的L-ASNase酶活Table 3 Placket-Burman experimental design and corresponding L-ASNase activity

表4 Placket-Burman實驗中各因素的影響Table 4 Effects of variables in the Placket-Burman experiment

注：R2=0.966 2，校正系數=0.907 0。

由表4中效應或預測系數可知，9種成分中蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、MgSO4·7H2O對酶活表現為正效應，其他因素表現為負效應。由p值可知，蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、KH2PO4和NaCl對酶活的影響顯著(p值<0.05)，其他4種因素對酶活影響不顯著(p值>0.05)。對酶活影響不顯著的因素(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O和L-天冬酰胺效應均為負，接下來的實驗質量濃度均取Plackett-Burman實驗的低水平，即質量濃度分別設為：4、22.5、2 g/L，MgSO4·7H2O效應為正，取高水平，即質量濃度設為1 g/L。下一步將對上述5種顯著因素的質量濃度水平進行優化。

2.3 最陡爬坡實驗

在Plackett-Burman實驗基礎上，運用最陡爬坡實驗對蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、KH2PO4和NaCl等5種對酶活影響顯著的因素進行優化，以確定各因素進行CCD實驗的水平中心。綜合考慮正負效應和原料成本，確定最陡爬坡實驗各因素的水平，如表5所示。由表5可知，第4組實驗獲得的酶活最大，故以該培養基組成為CCD實驗的水平中心。

表5 最陡爬坡實驗設計及結果Table 5 Experiment design of path of steepest ascent and the corresponding results

2.4 CCD實驗

按照表2采用CCD實驗來確定神經網絡優化需要輸入的數據，結果如表6所示。

表6 CCD實驗設計及結果Table 6 CCD experimental design and results

2.5 神經網絡模型的建立

“K重”交叉驗證的方法可以將建立的神經網絡模型很好的推廣到新數據，故選擇“K重”交叉驗證的方法對CCD實驗建立的數據樣本執行模型啟動。建立神經網絡模型時，隱藏節點數是需要指定的重要數值。如果將此值設定得過低，則會擬合不足；而如果過高，則會過度擬合[22-23]。在經過大量神經網絡訓練后，確定折數為5，隱藏節點數為7，采用5×7×1的3層神經網絡結構，如圖4所示。即5個輸入神經元，分別代表蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、KH2PO4和NaCl；7個隱含層神經元；1個輸出神經元，代表酶活。設置折數5，隱藏節點數為7，過擬合罰項0.001，歷程數20，最大迭代數50，收斂準則0.000 01，執行神經網絡模型的擬合迭代過程。訓練擬合決定系數R2為0.978 5(圖5-A)，驗證擬合決定系數R2為0.995 1(圖5-B)，說明該5×7×1的3層神經網絡結構能很好地對數據樣本進行擬合。

圖4 神經網絡結構圖Fig.4 Structure of artificial neural network

圖5 酶活預測值與實際值相關性Fig.5 The correlation of actual values and the predicted values

2.6 神經網絡模型優化結果分析

為了考察5種顯著成分對L-ASNase酶活的影響，利用JMP10.0中的刻畫器功能進行分析，結果如圖6所示。

圖6 神經網絡預測刻畫圖Fig.6 Prediction plot of the neural network

由圖6可知，蔗糖質量濃度對酶活有較大的影響。隨著蔗糖質量濃度的增加，酶活逐漸增加，在蔗糖質量濃度為65 g/L時達到最大。繼續增加蔗糖質量濃度，酶活反而下降。這可能是因為過高的蔗糖質量濃度會導致有機酸積累，抑制菌體生長[20]，從而導致產量下降。隨著酵母蛋白胨質量濃度的增加，酶活也逐漸增加，在酵母蛋白胨質量濃度為28 g/L時達到最大。繼續增加酵母蛋白胨質量濃度，酶活反而下降。這可能氮源質量濃度過高會導致菌體失水[20]。隨玉米漿質量濃度的增加，酶活反而下降。這可能是因為玉米漿質量濃度增加時耗糖速率也隨之增加，副產物也會增加[24]，不利于產酶。隨著KH2PO4質量濃度的增加，酶活先增加后減小。這可能是因為KH2PO4和K2HPO4的加入可以促進菌體生長和外源蛋白的合成，但過高的KH2PO4濃度會導致菌體衰退[25]。隨著NaCl質量濃度的增加，L-ASNase酶活先增大后減小，過高的鹽濃度會破壞滲透調節，對菌體生長不利[26]。

由預測刻畫圖可知，當蔗糖為65 g/L、酵母蛋白胨28 g/L、玉米漿11 g/L、KH2PO411.5 g/L、NaCl 3.3 g/L時，L-ASNase酶活最大預測值為517.3 U/mL。為了驗證神經網絡模型預測的準確性，利用此培養基進行3次獨立實驗。結果表明，在優化的培養基條件下，L-ASNase酶活平均值為515.6 U/mL，和預測值十分接近，說明建立的神經網絡模型能有效地進行預測。

3 結論

本研究使用單因素實驗和Plackett-Burman實驗篩選出培養基中影響酶活的5個顯著因素分別為：蔗糖、酵母蛋白胨、玉米漿、KH2PO4和NaCl。通過CCD實驗建立數據樣本，使用JMP10.0神經網絡平臺構建了5×7×1三層神經網絡結構。該模型預測值和實際值十分接近，能準確地反映出網絡輸入元與輸出元之間的映射關系。最終得到最優培養基組成為：蔗糖65 g/L、酵母蛋白胨28 g/L、玉米漿11 g/L、KH2PO411.5 g/L、NaCl 3.3 g/L、(NH4)2SO44 g/L、K2HPO4·3H2O 22.5 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、L-天冬酰胺2 g/L。在最優培養基條件下，L-ASNase酶活可達515.6 U/mL，和優化前相比酶活提高了90.9%。本研究的L-ASNase最終產量雖然低于KHUSHOO[12]和SUSHMA[14]報道的發酵罐水平產量，但比其搖瓶水平高很多，具有較大的潛在能力，為實現重組B.subtilis高效生產L-ASNase提供了基礎數據。