采用雙水相萃取技術提取ε-聚賴氨酸

馬玉，張龍，陳旭升，毛忠貴

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是一種由放線菌生產的氨基酸同型聚合物，由25～35個L-賴氨酸殘基通過α-羧基與ε-氨基形成的ε-酰胺鍵連接而成[1]。ε-聚賴氨酸的水溶性好、熱穩(wěn)定性高，在中性和偏酸性條件下對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、酵母及其他真菌、病毒都有抑制作用，抗菌譜廣，為綠色生物防腐劑[2]。ε-聚賴氨酸由白色鏈霉菌(Streptomycesalbulus)發(fā)酵生產。關于ε-PL的提取，目前主要是采用離子交換技術和膜技術進行分離，之前所有提取工藝的核心步驟均是離子交換樹脂，膜技術只是在固液分離方面有所應用。最具借鑒意義的是2003年美國FDA公布的ε-PL提取工藝[3]。采用0.10 μm的微濾膜過濾作為固液分離方式，收集透過液經過一道色譜層析(文件中未提及該色譜類型)，隨后使用三道離子交換柱進行分離和精制，三道離子交換的順序依次為弱酸樹脂、強堿樹脂和強酸樹脂，將經過三道離子交換的料液進行活性炭除雜，最后經過濃縮干燥得到ε-PL樣品。該工藝采用微濾膜進行過濾，降低了離子交換樹脂污染的風險，最終可獲得高純度樣品，但該提取工藝關鍵的色譜、樹脂類型及使用條件沒有詳細的闡明，而且ε-PL的發(fā)酵液黏度大，幾乎不可能采用微濾膜直接過濾，推測該固液分離方式可能是針對固定化發(fā)酵模式，同時整個工藝操作程序繁瑣，收率不高。

國內最近的關于ε-PL提取工藝是2015年甄斌提出的ε-PL絮凝劑提取工藝[4]。調節(jié)發(fā)酵液pH至1.5后加入絮凝劑，充分絮凝后使用板框過濾，收集過濾液依次進行微濾和超濾，收集透過液，調節(jié)pH至8.5后使用弱酸陽離子樹脂吸附和洗脫，洗脫液調節(jié)pH至7.0進行大孔樹脂SX-8脫色，脫色液使用1 kDa超濾脫鹽并收集截留液，最后使用冷凍干燥獲得樣品。過濾依次采用板框過濾、微濾和超濾，最終獲得十分澄清的料液，消除了樹脂污染的風險，采用大孔樹脂脫色大幅度降低了該步驟的ε-PL損失率，但最終獲得產品純度不高，并且同樣出現(xiàn)操作程序繁瑣的問題?？紤]到ε-聚賴氨酸提取投資大、成本高、價格昂貴，限制了ε-PL的廣泛應用。因此，對ε-PL分離提取方法進一步的探索研究是有重要意義的。

查閱相關資料，目前還沒有關于利用雙水相技術來初步萃取ε-PL的詳細研究。雙水相萃取技術是指一種或幾種物質以適當?shù)馁|量分數(shù)溶解在水中，在一定的條件下形成互不相溶的水溶液體系，如聚合物/聚合物/水、聚合物/無機鹽/水、聚合物/有機鹽/水、表面活性劑/表面活性劑/水、小分子有機溶劑/無機鹽/水等體系[5]。雙水相萃取技術具有萃取條件溫和、處理量大、萃取率高、兩相分離快、能耗低、設備投資少等優(yōu)點，有望在生物化工、細胞生物學和生物化學等領域得到應用[6]。本文深入研究了乙醇/硫酸銨雙水相體系對提取ε-PL的影響，雜質的去除情況，并探究了多次萃取效果，嘗試研究出一條簡便高效的ε-PL提取工藝路徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

發(fā)酵液由本實驗室自己提供，制備方法見文獻[7]；聚賴氨酸標準品，鄭州拜納佛生物工程有限公司；無水乙醇，分析純級，甲基橙，考馬斯亮藍G250以及其他一些藥品皆為分析純級別。

紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；高效液相色譜儀，美國Agilent公司；高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；切向超濾系統(tǒng)，美國Millipore公司；AR224CN分析天平，奧豪斯儀器有限公司；FE20 pH計，瑞士 Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 ε-PL在雙水相體系中的分配系數(shù)篩選

發(fā)酵液先經過14 000×g離心，除去菌體，保留上清液在4 ℃保存?zhèn)溆?。? g無機鹽，18 g離心清液體和6 g有機溶劑，漩渦振蕩5 min混勻，室溫靜置2 h。使用該方法比較不同雙水相體系對ε-PL的分離效果。其中ε-PL在上相濃度Ct和下相濃度Cb之比為ε-PL的分配系數(shù)(K)。

1.2.2 乙醇/硫酸銨雙水相相圖

采用濁度滴定法來獲得乙醇/硫酸銨雙水相相圖。將小三角瓶置于分析天平上，調零；加入一定量的50%濃度的硫酸銨溶液，記錄重量后調零；接著加入一定量的無水乙醇，邊振蕩邊滴加，直到混合物出現(xiàn)渾濁狀態(tài)，顯示溶液中已經形成不相容的兩相，記錄重量后調零；接著向混合物中加入去離子水直到溶液變澄清，表明水溶液已經變成單相，記錄水重量后調零；接著再一次滴加無水乙醇，重復上述步驟。累計到一定數(shù)目的點后，分別以硫酸銨質量分數(shù)和無水乙醇質量分數(shù)為橫坐標和縱坐標，得到乙醇/硫酸銨雙水相相圖[8]。

(1)

(2)

式中：ω1和ω2分別表示無水乙醇質量分數(shù)和硫酸銨質量分數(shù)；m1、m2和m3分別表示無水乙醇、硫酸銨和水的質量。

考慮到ε-PL對相分離的影響作用，硫酸銨直接加入到ε-PL標準品溶液中，按照上面提到的濁度滴定法獲得相圖。

1.2.3 乙醇和硫酸銨濃度對ε-PL分配系數(shù)的影響

取硫酸銨6 g加入到經過離心后的發(fā)酵液中(pH 9.50)，硫酸銨最終質量分數(shù)為20%。接著，加入無水乙醇構建雙水相萃取ε-PL，乙醇質量分數(shù)范圍20%～26.7%(該范圍外的濃度無法形成雙水相體系)，使用該方法來考察不同的乙醇濃度對ε-PL分配系數(shù)的影響。同樣的，在體系中維持20%的乙醇質量分數(shù)，向體系中加入不同量的硫酸銨，使硫酸銨最終質量分數(shù)在20%～26.7%(該范圍外的濃度無法形成雙水相體系),考察不同硫酸銨濃度對分配系數(shù)的影響。

計算色素的去除率和蛋白質的去除率，發(fā)酵液中原來總的色素量減去上相中的色素含量除以總的色素量為色素去除率，蛋白質去除率的定義與之相同[9]。

1.2.4 乙醇和硫酸銨濃度的測定

硫酸銨濃度的測定依據(jù)文獻[10]的方法進行測定。乙醇濃度依據(jù)文獻[12]的方法進行測定。

1.2.5 pH對ε-PL的分配系數(shù)的影響

以20%的硫酸銨和20%的無水乙醇構建雙水相體系，考慮到調節(jié)pH時，無水乙醇會產生一定干擾[12]，所以硫酸銨溶于發(fā)酵液清液后，即用NaOH溶液調節(jié)該溶液pH值，溶液pH值依次為5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0?？疾觳煌膒H對ε-PL在雙水相體系中分配系數(shù)的影響。同時計算色素和蛋白質去除率，以及ε-PL的回收率。

1.2.6 多次萃取的比較

在最佳的萃取條件下(硫酸銨和乙醇質量分數(shù)分別為20%和20%，pH 9.5，25 ℃),進行第1次萃取。之后，向第1次萃取的上相加入相同體積并且組成成分相同的新鮮下相進行第2次萃取，混合物振蕩5 min，靜置2 h待兩相分離。下面幾次萃取按照相同的方法進行[13]。

1.2.7 分析方法

ε-PL濃度測定參照文獻[14]方法。HPLC檢測純度采用文獻[14]的方法，TSK gel ODS-120T 色譜柱(φ 6 mm×25 cm),紫外檢測器,檢測波長215 nm，柱溫40 ℃，流動相為K2HPO41.7 g和Na2SO41.42 g溶于800 mL水中，用磷酸調節(jié)pH值至3.4后，用水定容至1 000 mL，取920 mL加入80 mL乙腈，進樣量為20 μL。蛋白質濃度測定采用考馬斯亮藍法[16]，色素測定參照文獻方法[17]。分配系數(shù)(K)，ε-PL收率(Y)，Vr體積比按公式(3)、(4)和(5)計算：

乙醇/硫酸銨(質量分數(shù)20%/20%)萃取ε-PL形成的雙水相圖1 ε-PL在乙醇/硫酸銨雙水相體系中的分配()Fig.1 Partitioning of ε-PL in aqueous two-phase system

(3)

(4)

(5)

式中:Ct和Cb分別代表的是上、下相中ε-PL的濃度;Vt和Vb分別代表上、下相的體積。

2 結果與分析

2.1 ε-PL在雙水相體系中的分配情況

表1表示的是ε-PL在雙水相體系有機相/無機鹽中的分配系數(shù)。

由表1可以知道，在乙醇/硫酸銨雙水相體系中ε-PL的分配系數(shù)要高于其他雙水相體系，達到18.27，收率為97.89。大部分的雙水相體系中，ε-PL的分配系數(shù)值的范圍為0.40～1.60之間。結果表明，相比較其他雙水相體系，在乙醇/硫酸銨雙水相體系中，ε-PL主要分配于上相，更容易回收。

表1 ε-PL在不同的雙水相體系中的分配系數(shù)(25℃,有機溶劑/無機鹽質量分數(shù)20%/20%)Table 1 Partitions coefficients of ε-PL in different organic solvent/salt system

注：“-”表示體系不形成雙水相。

目前，相關資料文獻報道，對于有機溶劑/無機鹽雙水相體系形成主要影響因素為有機溶劑和無機鹽性質，其次體系的溫度、pH值等外界因素也有一定的影響[18]。初步判斷，在溶液中，無機鹽會和有機溶劑競爭水分子[18]。因此，水化能力較強的無機鹽更易爭奪水分，形成較強的相分離能力，即形成雙水相體系。在ε-PL的萃取實驗中，可以基本得出雙水相形成能力的大小依次為：(NH4)2SO4、NaH2PO4、KCl、NaCl、Na3PO4，這與文獻中得到的結果相一致[19]。而相同的，極性較強的有機溶劑會競爭性聚集更多的水分子。這也就能理解為什么乙醇/無機鹽雙水相體系更易形成雙水相的狀態(tài)。而對于甲醇和其他一些無機鹽形成雙水相一般是比較困難的，這主要是因為甲醇和水分子之間有很強的親和力，互溶能力強，不能形成雙水相。這也是其他有機溶劑/無機鹽無法形成雙水相體系的原因，當然，無機鹽的離子形式也有一定的影響。目的物ε-PL是一種親水性的聚合物，乙醇/無機鹽形成的雙水相中，乙醇相比較與其他有機溶劑有著更強的競爭水分子的能力，所以該類體系中上相的水分子更多，所以ε-PL更易分配于上相，從表1數(shù)據(jù)結果也可以看到，乙醇/硫酸銨，乙醇/磷酸二氫鈉形成的雙水相體系，ε-PL的分配系數(shù)和收率都比其他形成的雙水相體系結果要高，尤其是乙醇/硫酸銨雙水相體系的萃取能力與效果更強。

考慮到硫酸銨價格便宜，而乙醇的安全性能相對高等綜合因素，因而選擇乙醇/硫酸銨雙水相體系作為下一步實驗的萃取ε-PL體系研究對象。

2.2 乙醇/硫酸銨雙水相相圖

為了研究合適的相組成比例，分別以ε-PL溶液和去離子水作為溶劑得出了乙醇/硫酸銨雙水相相圖。如圖2所示，在ε-PL溶液中得到的雙水相相圖，在相同的硫酸銨濃度條件下，乙醇濃度要比在去離子水中得到的雙水相相圖略微低一些，主要因為ε-PL的存在加強了兩相的形成。雙水相的形成不僅與成相有機溶劑和無機鹽性質有關，還與體系的pH值、溫度等外界條件有關。目前對于這一體系的相分離解釋主要是無機鹽，有機溶劑與水分子締合競爭的結果[18]，在這里ε-PL的存在可能加強了這種締合競爭的作用。由于相分離影響因素很多，所以這類體系的具體形成機理還有待進一步探索。

圖2 乙醇/硫酸銨雙水相相圖Fig.2 Effect of ε-PL on phase diagram of ethanol/ammonium sulfate

圖3表示的是在乙醇/硫酸銨雙水相體系中成相位置，M為成相點，乙醇/硫酸銨質量分數(shù)為20%/20%，pH9.5。靜置分層形成兩相后，兩相中的乙醇和硫酸銨含量出現(xiàn)較大的變化。T代表上相中的乙醇和硫酸銨質量組成，B代表下相中乙醇和硫酸銨的質量組成情況，上相中乙醇和硫酸銨的含量分別為38.78%和8.12%。而下相中乙醇和硫酸銨含量分別為8.82%和27.31%。此時，ε-PL主要分配在上相。這可能主要是因為下相中由于無機鹽濃度較高，產生鹽析作用使ε-PL溶解度降低，所以不易分配于下相。其次ε-PL等電點為9.0[14]，在pH9.5時，ε-PL大都以電中性和少量負電狀態(tài)存在，而體系中由于電離作用，無機鹽產生的陰、陽離子在兩相中進行分配最終達到平衡時，會在上下相之間產生電位差，會驅使ε-PL分配于上相。點M為整個系統(tǒng)的組成，當M點向下移動時，系線長度TB縮短，兩相差別減小，當系線為零時，兩相差別消失而成為一相，即不分相。對于雙水相體系的形成，根本原因可能是因為兩相極性大小產生差異，所以體系發(fā)生分離產生兩相，沒有互溶。介電常數(shù)通常用來預測溶液的極性性質[20]，在實驗中上相主要為38.87%的乙醇，其介電常數(shù)大約為60 F/m，而對于下相主要為27.31%的無機鹽溶液，其介電常數(shù)大約為78 F/m?？梢钥闯錾舷孪嘀g極性出現(xiàn)差異，產生兩相。對于雙水相的成相原因還有其他文獻給出一些解釋[7]。同時，根據(jù)“相似相溶”的原理，目的物極性大小可能更接近于上相，所以更易分配于上相。

M-成相點；T-上相組成；B-下相組成圖3 乙醇/硫酸銨雙水相相圖和成相點Fig.3 The phase diagram and phase point of the aqueous phase carbonate ATPS

2.3 乙醇和硫酸銨濃度對ε-PL分配系數(shù)的影響

在固定乙醇質量分數(shù)20%的條件下，探究硫酸銨濃度對ε-PL分配系數(shù)和收率的影響。如圖4所示，隨著硫酸銨濃度的增加，ε-PL的分配系數(shù)(K)先減小后增大。這主要是因為隨著體系硫酸銨濃度的增加,硫酸銨和乙醇競爭水分子，上相中水的含量遞減，下相中水的含量增加，而ε-PL是親水性的物質，更易趨向于水含量較大的相，因此分配系數(shù)K出現(xiàn)降低趨勢。但隨著硫酸銨濃度繼續(xù)增加，由于鹽析作用影響越來越大，所以分配系數(shù)K會出現(xiàn)回升的現(xiàn)象。

圖4 硫酸銨對ε-PL分配系數(shù)和收率的影響Fig.4 Effect of ammonium sulfate on partition coefficients and recovery of ε-PL

同時，檢測了在不同硫酸銨濃度條件下，蛋白和色素的去除情況。如圖5所示，隨著硫酸銨濃度的增加，蛋白和色素的去除率在增加，但硫酸銨濃度的變化對它們的影響不明顯。在ε-PL的生產提取中，色素主要來源于兩個方面，一是有機氮源、滅菌過程中的美拉德反應產物，另外就是產生菌自身分泌的色素物質[21]，發(fā)酵液中的色素可能多以水溶性帶負電荷的非極性大分子色素為主，與ε-PL結合較為緊密[22]。推測隨著硫酸銨濃度增加導致下相競爭的水分子含量增加，而色素和蛋白質都具有一定的親水性，所以二者易趨向于下相，去除率有所提升。ε-PL的回收率(Y)先減小后增大與分配系數(shù)K呈現(xiàn)相同變化趨勢，這主要是因為在整個實驗過程中，雙水相兩相的相體積比變化很小。

圖5 硫酸銨對色素和蛋白質去除的影響Fig.5 Effect of ammonium sulfate on the removal rate of protein and pigment

同理，在硫酸銨質量分數(shù)為20%條件下，探究乙醇濃度對ε-PL分配系數(shù)和收率的影響。如圖6所示，隨著乙醇濃度的增加，ε-PL的分配系數(shù)和收率均呈現(xiàn)減少的趨勢。這主要是因為，隨著乙醇含量的增加，上相的乙醇含量占的比重增加，相對應的在上相中的水分子含量在減少，這就會導致親水性的ε-PL在上相中的含量減少，所以出現(xiàn)分配系數(shù)減少的情況。又由于，整個實驗過程中，兩相體積的相體積比率變化很小，所以ε-PL收率基本是隨著ε-PL分配系數(shù)的變化而變化。同時，可以看出隨著乙醇濃度的增加，蛋白質和色素的去除率變化呈現(xiàn)相反的趨勢，如圖7所示，隨著乙醇濃度的增加，蛋白的去除率在減少，而色素的去除率略微增大。當然，二者的去除率大約都在35%～40%之間，變化不大。

圖6 乙醇對ε-PL分配系數(shù)和收率的影響Fig.6 Effect of ethanol on partition coefficients and recoveries of ε-PL

圖7 乙醇對色素和蛋白質去除的影響Fig.7 Effect of ethanol on the removal rate of protein and ε-PL

綜上所述，可以得出在乙醇/硫酸銨雙水相體系質量分數(shù)濃度為20%/20%條件下，可以獲得最大的ε-PL分配系數(shù)和收率，而對于繼續(xù)降低乙醇/硫酸銨體系濃度無法形成雙水相。因此，選擇乙醇/硫酸銨體系質量分數(shù)為20%/20%進行接下來的實驗。

2.4 pH值對ε-PL分配系數(shù)的影響

圖8-b表示的是不同pH條件下,蛋白和色素去除率的變化情況?？梢钥吹絧H的變化對色素的去除率影響不大，而對蛋白的去除作用影響較大。前文中已提到，發(fā)酵液中的色素可能多以水溶性帶負電荷的非極性大分子色素為主，與ε-PL結合較為緊密[22]。ε-PL的等電點為9.0左右[14]，隨著pH的增加，ε-PL的帶電狀態(tài)也在變化，但整體而言還是多以電中性居多，少量帶有負電荷，所以色素和ε-PL的結合量仍然較多，所以pH的變化對色素的去除影響不大。對于發(fā)酵液中的雜蛋白，推測多為堿性蛋白質，分子質量分布在6.64萬以下，1.43萬以下分子質量約占1/4，最后基本通過后續(xù)的膜技術去除掉[22]。所以蛋白質去除率在增加，這應該是由于pH的逐步增加，改變了許多堿性蛋白質的帶電狀態(tài)，使得蛋白質分布發(fā)生變化，最終導致了蛋白質去除率的改變。

圖8 不同pH條件下ε-PL分配系數(shù)和收率的變化情況Fig.8 (a) Effect of pH on partition coefficients and recovery of ε-PL and on the removal rate of protein and pigment

綜上可得，最佳的ε-PL雙水相萃取條件，乙醇/硫酸銨體系，質量分數(shù)濃度分別為20%/20%，在pH為9.5條件下進行實驗操作。

2.5 多級萃取

為了考察對蛋白和色素等雜質的進一步去除效果，在前面實驗優(yōu)化出來的最佳條件下進行了多級萃取，乙醇質量分數(shù)為20%，硫酸銨質量分數(shù)為20%，pH 9.5條件下，進行萃取。已知經過一步萃取，蛋白去除率達到57.23%,色素去除率37.68%。分離出經過第1次萃取的上相，在保持萃取的最優(yōu)雙水相體系乙醇/硫酸銨(質量分數(shù)20%/20%)條件下，加入新的構成相同的下相，進行第2次萃取。收集第2次萃取的上相，加入新鮮構成相同的下相，進行第3次萃取，同樣的，依次進行下面的萃取。

表2 利用雙水相對ε-PL多級萃取結果(25 ℃)Table 2 Multi-stage extraction of sodium carbonate/ethanol ATPS(25 ℃)

注：表中萃取0次，即起始的發(fā)酵液上清。

由表2可知，隨著萃取次數(shù)的增加，ε-PL的分配系數(shù)在減小，另外由于兩相體積比也在略微減少，可以看出ε-PL的收率也在減小，當進行第4次萃取時，收率減少到92.01%。可以看出，當進行完第4次萃取時，損失率明顯加大，然而蛋白和色素去除率并沒有明顯的增加。發(fā)酵液中雜蛋白多以堿性蛋白為主[22]，經過3次最優(yōu)條件下萃取，可以說基本被去除掉，所以進行第4次萃取時蛋白的去除率變化很小了。而對于其中的色素，前文也已提到，色素多以水溶性帶負電荷的非極性大分子色素為主，一般與目的物ε-PL結合的較為緊密，所以可以看出，在每一次的萃取過程中色素的去除率都不高[22]。但是，每一次構建新的雙水相體系時，都會引入新鮮的去離子水，而色素又具有一定的親水性，所以隨著萃取次數(shù)增加，色素也得到一定的去除，在進行3次萃取后，與ε-PL結合不是很緊密的色素基本得到了去除，當再進行第4次萃取時，與ε-PL結合很緊密的色素去除基本很少了。因此，鑒于以上原因，采用該雙水相體系萃取ε-PL的最佳次數(shù)為3次。而對于每次萃取乙醇的損失率大約在31%，損失較大，后期可以通過蒸餾等方法進行回收。

2.6 HPLC分析

通過液相分析可以得知，經過3次萃取可以去除大部分雜質。圖9-c表示的是起始發(fā)酵液液相圖，通過對比可以得出，雜質主要分配于下相被去除(圖9-a所示)，最后ε-PL主要被分配在上相，占主要成分被收集(圖9-b所示)，雜質的含量在逐漸減少。通過液相圖9-a可以看出，在第3次萃取時，ε-PL在下相中的含量要明顯高于第1次和第2次萃取的下相，說明ε-PL的損失率在持續(xù)增加，根據(jù)表2中實驗結果數(shù)據(jù)也可以得到證明，最后在進行第4次萃取時的ε-PL損失接近9%，損失率進一步增大。因此，進行3次萃取是獲得ε-PL的較好方案。

a-每次萃取下相的液相圖(215 nm)；b-每次萃取上相的液相圖(215 nm)；c-發(fā)酵液的液相圖(215 nm)虛線表示ε-PL的出峰時間點圖9 3次萃取Fig.9 HPLC graphs of ε-PL from ATPE

收集經過3次萃取之后的上相，利用前期工作篩選出的超濾膜進一步脫鹽除雜，獲得超濾液可以進行活性炭脫色并真空干燥最后獲得產品，如圖10-a所示。最后，ε-PL的收率和純度分別可以達到68.28%和92.39%。純度92.39%距國家標準95%還有一點差距，主要雜質是色素和雜蛋白，可以再通過去除色素和去蛋白的工作純化，需后續(xù)繼續(xù)研究。

a-本實驗最后提取的干燥成品；b-符合國家標準的ε-PL合格樣品圖10 最后干燥成品Fig.10 The dry sample of the extracted ε-PL

3 總結

利用雙水相萃取技術可以很好的從發(fā)酵液中萃取回收ε-PL，本文中探究了多個有機溶劑/無機鹽的雙水相萃取體系，經過實驗得到乙醇/硫酸銨雙水相體系要優(yōu)于其他雙水相體系，并優(yōu)化了萃取條件，在pH 9.5,乙醇/硫酸銨質量濃度分別為20%/20%條件下，1次萃取收率可以達到98%左右，分配系數(shù)達到18.33左右。在此基礎上探究了多次萃取的效果，并最終確定進行3次萃取作為最佳方案，發(fā)酵液經過3次萃取后，雜質被大量的去除，ε-PL被濃縮收集，收率達到96%左右，純度由最初的19.53%提升到40%左右。為了進一步除雜脫鹽，收集3次萃取后的上相成分，利用超濾膜進行脫鹽處理，最后的收率和純度分別達到68.28%和92.39%，蛋白質和色素的去除率分別可以達到86.56%和60.01%。可見，雙水相萃取技術對于ε-PL的分離提取是個有價值的思路。