自噬相關蛋白Bec lin1、LC3-Ⅱ、Atg5在前列腺腺癌組織中的表達及意義

王錢虎

310006 杭州市第一人民醫院中心實驗室

前列腺腺癌（prostatic adenocarcinoma，PCa）是常見的男性泌尿生殖系惡性腫瘤之一，在全世界范圍內其發病率居第2位，死亡率居第5位[1]。在我國PCa是男性泌尿生殖系發病率最高的腫瘤，其年發病率高達12.07%。PCa早期臨床癥狀不典型，確診時大多已為進展期，24%～35%的患者在初診時已發生轉移[2]。PCa分為腺癌、腺鱗癌、導管腺癌、鱗狀細胞癌、尿道上皮癌等五大類，其中腺癌占90%以上[3]。自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，在機體生理病理過程發揮廣泛而重要的作用；而且，自噬與腫瘤的發生、發展之間有密切關系[4]。有研究發現，自噬在PCa的發生、發展及轉歸中發揮重要作用[5]。本研究應用免疫組化法檢測PCa中自噬相關蛋白Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、自噬相關基因5（autophagyrelated gene 5，Atg5）的表達情況，并分析其與Gleason分級、前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）和臨床各參數的相關性，以探討自噬活動在PCa發病中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2014年3月至2016年3月在我院病理科保存的經直腸前列腺穿刺活檢PCa標本60例（觀察組），患者年齡 55～72（69.4±10.2）歲；按照 Gleason評分[6]：高分化（2～4分）16例，中分化（5～7分）18例，低分化（8～10分）26例。同時選擇良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）標本15例作為對照組，患者年齡 53～70（67.3±10.4）歲。兩組患者術前均未行放化療或內分泌治療。兩組患者年齡比較無統計學差異（P＞0.05）。

1.2 主要試劑 PSA檢測試劑盒（美國雅培公司）；Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5兔抗人單克隆抗體（美國 EPITMICS公司）；鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物連接法(SP)試劑盒及二氨基聯苯胺（DAB）顯色液（武漢博士德生物技術公司）。

1.3 血清PSA的檢測 在清晨安靜情況下抽取患者靜脈血4ml，采用化學免疫發光法檢測PSA，操作步驟嚴格按照說明書執行。

1.4 免疫組化染色 石蠟標本連續切片，常規脫蠟及水化，高壓熱修復抗原，封閉內源性過氧化物酶，依次加入 Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5一抗（均為 1∶1 000稀釋），洗滌后加入辣根過氧化酶標記二抗，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明及封片。

1.5 陽性結果判斷 由2位高年資病理醫師采用盲法獨立閱片，每張切片至少觀察5個高倍鏡視野。參照文獻[7]，按照染色強度評分：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，褐黃色計3分。按照陽性細胞所占百分比評分：陰性計0分；陽性細胞＜10%計1分，＞10%計2分，＞50%計3分，＞75%計4分?？偡e分（即上述2項評分的乘積）：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～6分為中強陽性，＞6分為強陽性。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。正態分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。計數資料用百分比表示，組間及不同臨床病理特征間自噬相關蛋白陽性率比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5陽性表達率的比較 Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5陽性表達均主要位于細胞質。觀察組中Beclin1、LC3－Ⅱ陽性表達率明顯低于對照組，但Atg5陽性表達率顯著高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者B ec l in1、LC3-Ⅱ、A t g5陽性表達率的比較[例（%）]

2.2 PCa組織中 Beclin1、LC3－Ⅱ、Atg5 表達與臨床參數的關系 Beclin1、LC3－Ⅱ的表達與Gleason評分、血清PSA水平、淋巴結轉移、骨轉移均有關（均P＜0.05）；而與年齡無關（P＞0.05）。Atg5的表達與年齡、Gleason評分、血清PSA水平、淋巴結轉移、骨轉移均無關（均P＞0.05）。見表 2。

表2 P C a組織中B ec l in1、LC3-Ⅱ、A t g5蛋白表達與臨床參數的關系[例（%）]

2.3 相關性分析 Beclin1與LC3－Ⅱ呈正相關（r=0.574，P＜0.05），而 Beclin1和 LC3－Ⅱ與 Atg5呈負相關（r=－0.513、－0.525，均 P＜0.05）。Beclin1 和 LC3－Ⅱ與 Gleason評分呈正相關（r=0.542、0.547，均 P＜0.05），而Atg5與Gleason評分無明顯相關（r=0.035，P＞0.05）。

3 討論

自噬是真核生物特有的進化上高度保守的代謝方式，它能通過清除氧自由基和受損細胞器，維持內環境穩態和基因組穩定，抑制腫瘤發生、發展；如自噬活性受損時，也可促進細胞惡變及腫瘤的發展[8]。自噬體的形成是一個涉及兩種泛素樣系統和多個自噬相關蛋白的多步驟過程，自噬體形成后與溶酶體融合，進而形成自噬溶酶體，將其吞噬的內容物降解掉。自噬體形成主要包括三個階段：起始階段：自噬小泡膜開始形成；延長階段：自噬小泡膜不斷彎曲、延長，進而包裹被吞噬的成分；融合階段：自噬小泡與溶酶體融合，通過溶酶體酶將被吞噬成分降解，然后自噬體膜脫落以再循環利用。細胞內的自噬活動在正常條件下處于較低水平，然而在多種誘導因素（如細胞因子、缺氧、缺乏營養等）的作用下可發生迅速增強。自噬實質上是細胞內消化大分子的過程，是自我保護的過程，其在腫瘤發生中的具體作用尚存在爭議。自噬活動可有利于腫瘤細胞適應環境的變化，降低其凋亡。但是，研究發現在人類腫瘤中常存在自噬調節基因的突變，提示自噬有一定的抗癌效應[9]。研究發現，在多種人類腫瘤中均存在自噬活性的變化，且在同一腫瘤的不同階段也存在著自噬活性的差異，提示自噬相關蛋白表達失調可能是一種新的腫瘤發生機制[10]。自噬在腫瘤治療中的具體作用同樣存在爭議。腫瘤細胞可通過自噬對一些抗腫瘤方法產生抵抗；而另一些抗腫瘤方法可通過誘導自噬促進腫瘤細胞的死亡[11]。關于自噬究竟是抑制腫瘤的發生的屏障，還是腫瘤的適應性應答是現在研究的熱點[12]。PCa的具體發病機制尚未完全闡明，其發生是遺傳、環境因素共同作用的結果。有研究顯示，自噬相關基因Beclin1在PCa患者中存在雜合性的丟失。而且，自噬能增加PCa對不同療法（包括抗激素療法、DNA損傷劑和放射療法）的敏感度，提示自噬在PCa的發病中可能起到抑制作用[13]。自噬在PCa發生、發展中的作用方式備受關注，PCa和內分泌密切相關。研究發現，PCa中自噬和雄激素水平相關聯，雄激素可對PCa細胞自噬發揮一定的調控作用，而通過調控自噬過程進而實現靶向性誘導PCa細胞的凋亡是一個具有研究潛力的治療方向[14]。

Beclin1為酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，是自噬體形成過程中的一個必需因子，它可介導其它自噬蛋白定位于吞噬泡，進而調控自噬體的形成及成熟[15]。LC3為酵母自噬相關蛋白Atg8的同源體。LC3一般以可溶性LC3-Ⅰ的形式存在；當自噬發生時，LC3和自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，轉變為脂溶性的LC3-Ⅱ。而LC3-Ⅱ的表達與自噬活性呈正比，是公認的自噬活性標記[16]。自噬過程受到自噬相關基因（Atg）的嚴格調控，而Atg5在自噬體形成過程中發揮關鍵作用[17]。在自噬體形成過程中，Atg5和Atg12結合，形成Atg5-Atg12泛素樣連接系統，再和外膜結合以促進自噬體膜的延伸，最后形成自噬體[18]。本研究結果顯示，PCa組織中 Beclin1、LC3-Ⅱ表達明顯低于BPH組織，提示Beclin1、LC3-Ⅱ在PCa發生早期發揮抑癌作用。PCa組織中Atg5表達顯著高于BPH組織，提示Atg5可能促進了PCa發生、發展。

Gleason評分因其與PCa的生物學行為及預后有良好的相關性，已得到廣泛的臨床應用，評分越高提示癌細胞分化和預后越差。研究發現，Gleason評分≥8分后切緣陽性率顯著高于＜8分者[19]。PSA是早期篩查PCa的重要指標，其正常范圍0～4.0ng/ml，大多數PCa患者血清PSA＞4.0ng/ml，但仍存在一定的假陽性和假陰性[20]。本研究進一步分析發現，Beclin1、LC3-Ⅱ的表達差異與Gleason評分、血清PSA水平、淋巴結轉移、骨轉移呈負相關；而與年齡無關。研究發現，Beclin 1、LC3-Ⅱ在PCa中陽性表達率明顯低于正常前列腺增生組織，而兩者在晚期PCa（C+D期）中陽性表達明顯高于早期（A+B 期）[21]。有研究顯示，Beclin-1、LC3-Ⅱ參與PCa的發生、發展；但Beclin-1、LC3-Ⅱ表達與Gleason分級無明顯相關[22]。上述結果提示，Beclin1、LC3-Ⅱ在PCa的不同發展階段發揮不同的作用。Atg5在PCa組織中表達明顯高于BPH，但Atg5表達與Gleason評分、血清PSA水平、淋巴結轉移、骨轉移均無顯著差異，與前期研究結果一致[23]，提示Atg5高表達可能是PCa變得前期分子時間，但其具體機制尚未明確。

綜上所述，本研究發現自噬相關蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在PCa組織中表達失調，提示自噬活動增強和自噬體形成增多在其發展過程中起著重要作用，進一步深入探討自噬在PCa發病中的作用機制對開辟新的治療途徑有重要意義。