血清 GP73、AFP、AFU 檢測對AFP低水平原發性肝癌的診斷價值

陳旭東 王倩倩 陳巧巧

315020 寧波大學醫學院附屬醫院檢驗科（陳旭東，王倩倩，陳巧巧）

糖原發性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是指由肝細胞或肝內膽管上皮細胞發生的惡性腫瘤，是我國常見惡性腫瘤之一，其病死率在惡性腫瘤中居第2位[1]，且呈逐年上升趨勢。目前，本病早期缺乏有效的監測指標，確診時大多數屬于中期甚至晚期，延誤了最佳治療時機。PHC的診斷方法除了病理學、影像學等檢查外，其血清標志物檢測也為臨床早發現、早治療提供一條重要途徑[2]。血清甲胎蛋白（AFP）是診斷PHC特異性的標志物，現已廣泛用于篩查、診斷、判斷、療效及預測復發。α-L-巖藻糖苷酶（AFU）也被認為是輔助診斷PHC的一項血清學指標。高爾基體蛋白73（GP73）則有望成為繼AFP、AFU后早期診斷PHC及判斷預后的新標志物[3]。筆者通過測定血清GP73、AFP、AFU水平，探討3者單獨及聯合檢測對AFP低水平PHC的輔助診斷價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2015年7月至2017年2月在我院住院的53例PHC患者（PHC組），其中男35例，女18例，年齡 41～70（57.3± 9.6）歲。納入標準：（1）所有患者均經B超、螺旋CT、肝活檢及病理檢查確診，符合中國抗癌協會制定的《原發性肝癌的臨床診斷與分期標準》。（2）所有PHC患者血清AFP檢測濃度＜200ng/ml。排除標準：排除PHC以外的其他惡性腫瘤患者。選擇同期良性肝病患者81例（良性組），其中男58例，女23例，年齡39～69（56.7±10.3）歲。其中肝硬化 35 例，慢性乙肝患者46例，均符合中華醫學會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]中肝炎和肝硬化的診斷標準。另選擇同期在本院行健康體檢者142例作為對照組，其中男90例，女52例，年齡 42～71（58.2±7.5）歲。經檢測 AFP及各型肝炎病毒標志物均為陰性，無肝、心、肺、腎功能異常。3組對象性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究所有對象均知情同意。

1.2 試劑與儀器 AFU檢測試劑由安徽伊普諾康生物技術股份有限公司提供（批號：20160928，60ml/瓶）。使用貝克曼庫爾特公司生產的AU5831全自動生化分析儀。AFP檢測試劑由貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司提供（批號：622454）；使用貝克曼庫爾特公司生產的DXI 800。GP73檢測試劑由北京熱景生物技術有限公司生產（批號：20160502）。使用北京拓普分析儀器有限責任公司生產的DEM－3洗板機、TECAN酶標儀。

1.3 標本采集 所有研究對象均空腹12h后，于次日清晨抽取空腹靜脈血5ml，室溫下靜置20min后以3 000r/min離心10min，取血清置于－20℃冰箱備用。

1.4 檢測方法

1.4.1 制備檢測GP73的標準曲線 利用試劑盒提供的系列 GP73 標準液 0、45、90、200、450ng/ml，以獲取的吸光度為橫坐標，以GP73標準濃度為縱坐標繪制標準曲線，見圖1。進行直線回歸得到方程式：y=233.87x+13.338，決定系數 r2=0.9952。

1.4.2 GP73、AFP、AFU 檢測 GP73、AFP、AFU 均嚴格按照試劑盒說明書進行操作，采用ELISA法測定血清GP73水平，采用微粒子酶聯免疫法檢測AFP，采用化學比色速率法檢測AFU。參考范圍：AFP＜20 ng/ml，AFU 11.3～40.0U/L，GP73＜150ng/ml。

圖1 ELISA法檢測G P73所使用的標準曲線

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，正態分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK－q方法；計數資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。靈敏度=真陽性數（/真陽性數+假陰性數）×100%；特異度=真陰性數（/真陰性數+假陽性數）×100%。

2 結果

2.1 3組對象血清GP73、AFP、AFU水平的比較 各組間血清GP73、AFP水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），均為PHC＞良性組＞對照組；PHC組和良性組間血清AFU水平比較無統計學差異（P＞0.05），但均高于對照組（均 P＜0.05），見表 1。

表1 3組對象血清G P73、A F P、A F U水平的比較

2.2 GP73、AFP、AFU單獨檢測和聯合檢測對AFP低水平PHC的診斷效能比較 單獨使用GP73、AFP、AFU對低水平PHC組進行輔助診斷的靈敏度依次為：62.3%、43.4%、22.6%，特異度依次為：72.6%、70.0%、66.8%，3者聯合檢測的靈敏度和特異度分別為88.7%、40.8%。可見GP73聯合AFP、AFU測定診斷PHC的靈敏度高于單一指標，特異度有所降低，見表2。

3 討論

血清AFP作為臨床上輔助診斷肝癌常用的血清標志物，其靈敏度較低，只有40%～65%[5]，因此臨床有30%以上的PHC患者血清AFP并不升高，即所謂AFP陰性PHC，易漏診、誤診。對早期肝癌，AFP的漏診率可達40%以上，進展期肝癌漏診率達15%～20%。單獨使用血清AFP診斷肝癌，其低值甚至陰性表達，易導致臨床醫生的忽視，在一定程度上影響了該指標的使用。而AFP在肝癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、膽道腫瘤及睪丸腫瘤等多種臨床疾病的患者血清中也會升高。因此尋求新的更加敏感或特異的血清標志物或血清診斷模式顯得越來越有必要[6]。

表2 3項指標單獨檢測和聯合檢測對A F P低水平P H C的診斷效能比較（%）

GP73是一種較新的血清學指標，該蛋白編碼基因位于人染色體的9q21.33，它可調節蛋白酶從多肽鏈的N端水解堿性氨基酸[7]。當肝臟發生癌變后，肝臟細胞中GP73的表達上調，從而使血清GP73水平的增高，推測其可能是由于GP73蛋白擴散進入血液循環導致[8]。GP73現已被證實為臨床上用于肝癌篩查的一種新的血清標志物。許多研究表明GP73的表達與PHC的發生有密切關聯，其靈敏度和特異度均超過了AFP[9－10]，本研究亦證實了該觀點。

AFU是一種溶酶體酸性水解酶，廣泛存在于哺乳動物的細胞和體液中，特別是在肝、腎組織中的含量最高[11]。近年研究發現PHC患者血清中AFU亦明顯升高，可作為PHC的預測指標[12－13]，對AFP檢測結果陰性和小細胞肝癌患者的診斷價值較大，可作為血清AFP未增高時早期篩查PHC的一個輔助指標。

本研究發現各組對象血清GP73水平比較有統計學差異，其升高水平PHC組高于良性組，而良性組有高于對照組；血清AFP檢測指標不同組間和GP73也有類似的分布；而對于血清AFU檢測指標，PHC組和良性組差異無統計學意義（P＞0.05），但均高于對照組（P＜0.05）；單獨使用GP73、AFP、AFU對PHC組進行輔助診斷的靈敏度依次為：GP73＞AFP＞AFU，特異度依次為：GP73＞AFP＞AFU，3者聯合輔助診斷低水平PHC的靈敏度最高，有助于PHC的早期診斷。與臨床上常用的AFP相比，GP73有更高的靈敏度，在血清AFP檢測結果為陰性的患者臨床意義尤為顯著，故GP73和AFP有較好的互補性。本研究證實血清GP73檢測指標可獨立用于AFP低水平PHC的輔助診斷，但3者聯合檢測能獲得最佳的診斷靈敏度，該研究成果值得廣大臨床實驗室推廣使用，以減少臨床對AFP低水平PHC患者的漏檢率。

綜上所述，GP73水平的測定可以作為AFP低水平PHC臨床診斷分子標志物。GP73、AFP及AFU 3者聯合檢測有助于提高低濃度AFP肝癌的診斷率，為肝癌的早期診斷提供可靠依據。本研究與其他文獻稍有差異[14]，可能與本實驗測量誤差及研究例數不足有關，有待于完善實驗方法進一步研究。