氟菌·霜霉威對煙草黑脛病的防效及其對煙株生長的影響

任曉芬，亓文哲，程星凱，劉政軍，姬小雪，喬康

1 山東農業大學，植物保護學院，山東泰安 271018;2 山東泰陽生物科技有限公司，山東泰安 271000

煙草黑脛病（Tobacco black shank）是由寄生疫霉（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）引起的危害煙草生產的重要病害，嚴重影響烤煙的產量和質量[1]。當前防治煙草黑脛病的主要措施仍為化學防治，如常規藥劑甲霜靈和烯酰嗎啉等[2]。近年研究發現常規殺菌劑在長期、高頻率使用下，對煙草黑脛病防效顯著降低，病原菌已對其產生不同程度的抗藥性[3]。因此，為保障煙葉生產的可持續發展，亟需篩選出具有新作用機理的殺菌劑替代當前常規藥劑。

氟菌·霜霉威（62.5 g/L氟吡菌胺+625 g/L霜霉威鹽酸鹽）是由德國一家公司研發的酰胺類復配劑。氟吡菌胺的穿透性、傳導性強，對病原菌的各形態均表現出很好的抑制作用[4]。霜霉威鹽酸鹽可以被植株葉片和根系快速吸收，在植株體內的上下傳導，能為植株的葉片、根莖等提供全面保護[5]。閆磊等[6]曾報道，氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽兩種單劑混用可有效防治黃瓜霜霉病，且防效優于單獨施用。目前，氟菌·霜霉威在煙草上處于試驗（試用）階段，尚未正式登記，其對黑脛病的防治效果有待進一步研究。本試驗通過室內毒力和溫室盆栽試驗明確氟菌·霜霉威對煙草黑脛病的防效及其對煙株生長、煙草葉片防御酶活性的影響，探明氟菌·霜霉威作為替代藥劑用于防治煙草黑脛病的潛力，為其合理使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌

煙草黑脛病菌采集自山東濰坊、泰安、臨沂3地的煙草病株，本研究根據許學明[7]建立的煙草黑脛病菌對甲霜靈的敏感性基線，得出所采集的煙草黑脛病菌株的抗性倍數在3.15～42.77之間。參照戰徊旭等[8]對菌株敏感性劃分標準，篩選出對甲霜靈抗性倍數最大的菌株（抗性倍數42.77倍，＞20，屬高抗菌株）。將該菌株的采集地記錄為濰坊市諸城市郝戈莊鎮，置于4℃冰箱保存，備用。

1.1.2 供試煙草品種

小黃金1025，為煙草黑脛病易感品種，由山東農業大學煙草研究室提供。

1.1.3 供試培養基

燕麥瓊脂（OA）培養基。

1.1.4 供試藥劑

98%甲霜靈原粉、90%精甲霜靈原油和97%烯酰嗎啉原粉，山東省聯合農藥工業有限公司提供；98%氟吡菌胺原粉和92%霜霉威鹽酸鹽原粉，濟南綠霸農藥有限公司提供；混劑原粉（98%氟吡菌胺原粉和92%霜霉威鹽酸鹽原粉以質量比1∶10混合），由山東農業大學農藥毒理與應用技術省級重點實驗室配制。25%甲霜靈可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、687.5 g/L氟菌·霜霉威懸浮劑，購于德國拜耳作物科學公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長的影響

采用菌絲生長速率法。預試驗中根據Sun等[9]共毒系數計算法得出原藥氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽質量比為1∶10時表現出最大增效。結合預試驗結果，用丙酮溶解各原藥，制備1×104mg/L的母液，并確定殺菌劑的有效系列濃度梯度，用無菌水進行稀釋。在無菌操作條件下，制備含藥培養基，并接種菌餅至含藥平板中央。以無菌水為對照，每處理重復3次，該室內毒力試驗重復2次。最后置于（27±1℃）恒溫培養箱內進行培養，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，求出藥劑對煙草黑脛病菌的EC50值等。

1.2.2 氟菌·霜霉威對煙草黑脛病的盆栽防效試驗

將生長一致的6葉煙苗移栽至花盆中，緩苗1周后分別用甲霜靈375 g a.i./hm2、烯酰嗎啉300 g a.i./hm2及氟菌·霜霉威 386.7 g a.i./hm2、773.4 g a.i./hm2以每株噴灑30 mL藥液對煙苗進行噴淋莖基部處理，以甲霜靈作為對照藥劑，清水處理作為空白對照，定義施藥當天為施藥0 d。3 d后，將煙草黑脛病菌孢子懸浮液（106cfu/mL）以每株50 mL接種至煙苗莖基部，脫脂棉保濕48 h，置于溫度（27±1℃），相對濕度95%的溫室中培養。盆栽試驗共施藥一次，每個處理均設4組重復，每組重復20株煙苗。于施藥后28 d記錄煙草黑脛病的發病率和病情指數。按照下列公式進行計算。

1.2.3 氟菌·霜霉威對煙草生長的影響

于施藥0 d、7 d、14 d、21 d觀察記錄煙株生長情況，并將施藥28 d煙草株高、莖粗、有效葉片數及光合速率等指標進行統計處理。

1.2.4 煙草抗病相關酶的活性測定

制備粗酶液參照劉太國等[10]方法。分別于施藥0 d、7 d、14 d、21 d、28 d取煙草植株由上向下第3～5片展開葉，置于-20℃保存，用于測定多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）的含量。每個處理重復3次。PPO活性的測定參考Aoariciocuesta的方法[11]；POD活性的測定參考愈創木酚法[12]；SOD活性測定采用NBT 光化還原法[13]：MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[14]。

1.3 數據處理

數據采用SPSS16.0軟件的最小顯著差數法（LSD）進行單因素方差分析（ANVOA）。

2 結果與分析

2.1 殺菌劑對煙草黑脛病菌的室內毒力

結果表明殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長均表現出抑制作用（表1）。其中，氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽以質量比1∶10的比例混用時，對菌絲生長的抑制效果最佳，EC50值為0.06 mg/L。氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽兩種單劑對病菌菌絲的EC50值分別為0.20 mg/L和3.30 mg/L，毒力低于兩種藥劑混用。此外，精甲霜靈和烯酰嗎啉對病菌的EC50值為0.70、2.02 mg/L，而甲霜靈對菌絲生長抑制效果較差，其EC50值為10.22 mg/L。

表1 6種殺菌劑對煙草黑脛病菌菌絲生長的影響Tab.1 Effect of six fungicides on mycelial growth of Phtophthora nicotianae

2.2 氟菌·霜霉威對煙草黑脛病的溫室盆栽試驗

2.2.1 氟菌·霜霉威對煙草黑脛病的防治效果

由圖1可知，各殺菌劑對煙草黑脛病表現出不同的防治效果。其中，氟菌·霜霉威-773.4處理能夠顯著降低煙草黑脛病的發病率，其防效達81.50%（圖1a），其次是氟菌·霜霉威-386.7處理，防效為73.67%，氟菌·霜霉威處理的防效均高于烯酰嗎啉（67.83%）和甲霜靈（55.75%）。

圖1 氟菌·霜霉威對煙草黑脛病的盆栽防效Fig.1 Effects of the combination of fluopicolide and propamocab hydrochloride control efficiency of tobacco black shank in greenhouse

2.2.2 氟菌·霜霉威對煙株生長指標的影響

盆栽結果表明，施用殺菌劑處理的煙草植株在株高、莖粗、有效葉片數、光合速率等指標上相比于空白對照均有不同程度的增加（圖2）。氟菌·霜霉威-773.4處理的煙草植株平均株高、平均莖粗分別是23.87 cm、12.83 cm（圖2a、圖2b），分別比甲霜靈增加了47.89%，18.24%，且該處理的光合速率值（7.94 μmol/m2·s）最高（圖2d），因此有利于提高煙葉光合產物的積累量。氟菌·霜霉威-386.7處理比甲霜靈處理能夠顯著提高株高和莖粗，對煙株表現出良好的促生效果。烯酰嗎啉處理在株高、光合速率值均低于氟菌·霜霉威-773.4處理。

2.2.3 氟菌·霜霉威對煙草葉片防御酶活性及MDA含量的影響

由圖3可知，整體來說施用氟菌·霜霉威能增強煙草葉片防御酶活性并降低MDA含量，防御酶的活性隨氟菌·霜霉威施用劑量的增加呈現出先升高后降低的趨勢，且隨藥劑劑量的上升其影響效果也越顯著。氟菌·霜霉威處理的煙葉PPO活性在施藥7 d 、14 d、21 d和28 d均高于甲霜靈處理（圖3a），且在施藥14 d時達到最大值122.42 U/（g·min FW），是空白對照PPO活性的1.97倍，表明氟菌·霜霉威能夠提高煙株PPO活性。在施藥14 d內，氟菌·霜霉威能夠顯著增強煙株的POD活性（圖3b），其POD活性最大可達空白對照的2.07倍，在施藥14 d后各處理的煙草POD活性均呈下降趨勢，但氟菌·霜霉威處理的POD值仍高于其他處理。接種病原菌后，氟菌·霜霉威在773.4 g a.i./hm2劑量時，煙草葉片的SOD含量在施藥14 d時達到峰值1.95 U/g （圖3c），比對照高22.73%。與空白對照相比，氟菌·霜霉威處理能夠顯著降低煙草葉片內的MDA的含量，最低可達1.18 μmol/g。

圖2 氟菌·霜霉威對煙草株高、莖粗、有效葉片數、光合速率的影響Fig.2 Effects of the combination of fluopicolide and propamocab hydrochloride on tobacco plant height, stem diameter, effective leaves and photosynthetic number in greenhouse

圖3 不同處理對煙草葉片防御酶活性及丙二醛含量的影響Fig.3 Dynamic curve of tobacco protective enzyme activities and content of MDA after different fungicides treatment

3 討論與結論

近年研究發現煙草黑脛病病原菌對常規殺菌劑已經產生不同程度的抗藥性。Yang等[15]發現煙草黑脛病菌株已對甲霜靈產生抗藥性；胡燕等[16]也證明了煙草黑脛病菌對烯酰嗎啉存在抗性風險。而氟菌·霜霉威作為一種高效、廣譜的復配殺菌劑，已應用于辣椒疫病和馬鈴薯晚疫病等多種病害的防治[17-18]，但尚未登記于煙草黑脛病的防治。本研究結果表明氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽兩種單劑均能抑制黑脛病菌絲生長，且兩種藥劑混用時對菌絲生長的EC50值僅為0.06 mg/L，顯著優于單獨使用的效果。溫室盆栽試驗也表明氟菌·霜霉威在推薦劑量773.4 g a.i./hm2時能有效防治煙草黑脛病，且防效顯著優于甲霜靈和烯酰嗎啉處理。

植株株高、莖粗、有效葉片數等是評價作物生長情況最基本的指標。本研究結果表明氟菌·霜霉威處理能夠提高煙草植株的株高、莖粗、有效葉片數等生長指標，促生效果顯著。劉波微等[19]的研究表明氟菌·霜霉威對作物具有保產增收的作用。植物抗逆境能力與PPO、POD及SOD等防御酶的活性高低有關，植物新陳代謝產生的活性氧會對細胞產生毒害作用[20]。本試驗結果表明，氟菌·霜霉威處理的煙草葉片PPO、POD和SOD活性均較對照組有所提高，這也可能是其促進煙草生長的原因。因此，氟菌·霜霉威可作為甲霜靈和烯酰嗎啉的替代藥劑用來防治煙草黑脛病。