第26屆國際生物學奧林匹克競賽試題實驗4·生物化學

佟向軍 范六民 劉寶玉 王戎疆 張 立

（1 北京大學生命科學學院 北京 100871 2 天津市第一中學 天津 300051 3 北京師范大學生命科學學院 北京 100875）

總分：100 分

考試時間：90 min

共20 題

考試目的:在本次考試中，將分析酶的動力學和酶的抑制劑。

考試包括2 個主要部分，每個部分包含3 個子部分。

第1 部分（57.5 分）

1.1 酶動力學介紹（理論）（0 分）

1.2 使用合成底物類似物pNP-Gal 的工業α-半乳糖苷酶的酶動力學實驗（實驗操作）（問題1～2：40 分）

1.3 α-半乳糖苷酶的酶動力學數據分析（問題4～11：17.5 分）

第2 部分（42.5 分）

2.1 酶抑制劑介紹（理論）（問題11～13：2 分）

2.2 α-半乳糖苷酶的抑制實驗（實驗操作）（問題14：27 分）

2.3 α-半乳糖苷酶的抑制動力學數據分析（問題15～20：13.5 分）

在考試開始之前，建議首先瀏覽整個試卷以了解大致內容。由于大多數分數設置在實驗部分，所以建議在開始計算和回答理論問題之前（第1.3、2.1 和2.3 部分）首先完成1.2 和2.2 部分。

材料與設備

為了完成實驗工作，需要下面列出的材料。請確保可以獲取這些材料。如果發現材料缺失，請在考試開始15 min 之內舉手示意考務人員。

A.1 個p200 移液器。使用移液器p200 轉移體積為20～200 μL 的液體，除非另有說明。

B.1 個p1000 移液器。使用移液器p1000 轉移體積為200～1 000 μL，除非另有說明。

C.p200 移液器的96 孔吸頭盒。 除非另有說明，否則每次移液后應丟棄移液器吸頭。

D.p1000 移液器的96 孔吸頭盒。 除非另有說明，否則每次吸液后應丟棄移液管吸頭。

E.＞30 個微量離心管（1.5 mL）

F.1 個微量離心管支架

G.2 個標有國家代碼+A 或B 的微量滴定盤

H.1 個微量滴定板模板

I.1 只秒表

J.1 支鉛筆

K.1 支記號筆

L.1 個計算器

M.1 把直尺

N.1 張用于示意考務人員的粉紅卡片

O.9 mL 2 mol/L Na2CO3（終止液）

P.6.5 mL 15 mmol/L pNP-Gal（底物）

Q.15 mL 超純水

R.5 mL 1 mmol/L pNP（標準溶液）

S.2 mL 0.024 mg/mL（酶）

T.5 mL 0.5 mol/L（抑制劑）

U.平板電腦觸控筆

第1 部分

1.1 酶動力學簡介

α-半乳糖苷酶可以催化α-半乳糖苷中末端半乳糖殘基的水解。通常，使用合成底物類似物對硝基苯基-α-半乳糖苷（pNP-Gal）測定α-半乳糖苷酶的活性，α-半乳糖苷被水解成半乳糖（Gal）和對硝基苯基（pNP）（圖1）。

pNP-Gal 是無色的，而pNP 產物為黃色并且其濃度可以通過微量滴定板讀數器確定405 nm處的吸光度。

圖1 半乳糖苷酶活性測定示意圖

在第1 部分中，將對水解速率對底物濃度的依賴性進行研究。為了達到這一目的，描述這種關系的Michaelis-Menten 圖（圖2）可用于估計2 個重要參數Vmax和Km（參見圖2 的圖例）。 初始反應速率Vo 可以由Δ［P］／Δt 確定，該值是單位時間內（Δt）的產物濃度（［P］）的變化。

圖2 Michaelis-Menten 圖

Lineweaver-Burk 圖中的參數Vmax 和Km 可以分別從Y 軸和X 軸截距確定（圖3）。 通過繪制初始反應速率（1／Vo）與底物濃度（1／［S］）的倒數的方法可以產生Lineweaver-Burk 圖。

圖3 Lineweaver-Burk 圖

1.2 工業α-半乳糖苷酶的酶動力學實驗

1.2.1 標準曲線 首先產生用于測量酶反應產物濃度（pNP）的標準曲線。 要產生標準曲線，你需要用終止液（Stop）稀釋1 mmol/L pNP 標準儲備溶液（Standard）。

問題1.標準曲線稀釋方案。

當需要使用時，要用終止液(Stop)稀釋1 mmol/L pNP標準儲備溶液（Standard）。 計算在500 μL 總體積中制備最終標準濃度所需的pNP 和終止液的體積。 在表1 中填入你的計算值。

表1 稀釋方案制備標準曲線

繪制標準曲線的步驟：

A.用記號筆標記上表第1 行中5 個1.5 mL 微量離心管（St1～St5）。

B. 將不同體積的1 mmol/L pNP 標準儲備溶液（Standard）轉移到標記的1.5 mL 管中（使用相同的吸頭）。

C.根據上表中的計算，將不同體積的終止液（Stop） 轉移到標記的管中。 將微量離心管倒置5次，使其與標準溶液徹底混合。

D.將100 μL 超純水（Water）轉移到微量滴定板A 的A1～A5 和B1～B5 孔中（使用相同的吸頭，參見圖4 和/或使用微量滴定板模板幫助你移液到正確的孔中） 。

E.轉移50 μL 上述最終溶液到相同的微量滴定板孔中。 每種溶液被分別轉移到2 個不同的孔中（下標I 和II，圖4）。

F.使用p1000 移液器向每個pNP 標準A1～A5和B1～B5 孔中添加100 μL 終止液（Stop）。通過將混合物上下顛倒2 次徹底混合。

圖4 微量滴定板A

現在繼續進行第1.2.2 部分，將酶反應混合物置于你的微量滴定板上。

重要提示：考務人員在考試的最后10 min 內將不再接收任何微量滴定板。 如果你感覺無法及時完成1.2.2 的部分，請通過舉起粉紅卡片告知考務人員。 你的操作結果將顯示在問題2 中。

1.2.2 酶動力學實驗

步驟：

準備pNP-Gal 底物稀釋溶液進行動力學實驗。

A.標記5 個1.5 mL 管，標記為S1 至S5（表2）。B.將15 mmol/L pNP-Gal 底物儲備溶液（Substrate）用標準1.5 mL 管中的超純水（Water）進行稀釋（表2）。 稀釋溶液應通過將管顛倒倒置5 次徹底混合。

表2 酶動力學測定的底物稀釋方案

C.將50 μL 每種稀釋的底物溶液（表2）和50 μL 超純水（Water）轉移到微量滴定板A G1～G5 和H1～H5。（參見圖4 和/或微量滴定板模板）。

D.將定時器設置為5 min，并在將酶溶液移至第1 孔后立即開始計時，以開始第1 次酶促反應（SI1），如下所述。

E.移取50 μL 0.024 mg/mLα-半乳糖苷酶（Enzyme），從SI1 和SII1 開始加入G1～G5 和H1～H5 孔，并繼續以相同的順序和間隔持續到SII5 以開始每個孔中的酶反應（以下稱為“酶反應混合物”）。為確保良好的混合，快速但輕柔地將50 μL 的混合物在每個孔中進行上、下2 次移液。

F.孵育5 min 后，使用p1000 移液管加入100 μL 2 mol/L Na2CO3溶液 （Stop），以與你開始的步驟相同的順序和速度終止孔G1～G5 和H1～H5 中的每個酶反應。通過將混合物上、下移動2 次混勻。

問題2.酶動力學實驗。

舉起粉紅色卡片上交你的的微量滴定板。 測量后，所得值將自動顯示在表3 中。

注意：在考試的最后10 min 內不會接受微量滴定板。

表3

1.3 酶動力學的數據分析

現在，你的任務是通過α-半乳糖苷酶測定底物水解的動力學參數。

首先，使用表4 中的數據確定產物（pNP）的標準曲線線性函數。 使用標準曲線可以計算反應混合物中的產物濃度，進一步可以通過確定初始反應速率（V0）計算每個底物濃度。

表4 用于模擬微量滴定板A 的標準數據，這樣可以避免1.2 部分的錯誤。 在實際情況下，使用你自己的數據進行計算。

表4 用于計算的吸光度數據（微量滴定板的第1～5 列）

問題3.標準平均吸光度。

計算表5 中給出的標準曲線的每個重復測量的平均吸光度。 輸入小數點后3 位數。

表5 標準曲線的平均吸光度

問題4.標準曲線線性函數。

在圖5 中，將pNP 的濃度（mmol/L）對應于吸光度（問題3 中計算出的平均A405nm）作圖。

圖5 估測pNP 產品標準曲線

在數學上僅使用2 個數據點St1 和St5 的平均吸光度確定標準曲線線性函數（見下文）的a 和b。 為a 和b 給出小數點的后3 位。

A405（405 nm 處的吸光度單位）=a·［pNP］（mmol/L）+b，其中a 是斜率，b 是Y 軸截距。

來自實驗部分1.2.2 的酶反應混合物的體積為150 μL。

問題5.反應時間。

將步驟中給出的反應時間單位設置為s。

問題6.動力學數據分析（無抑制劑）。

使用以下標準曲線方程式計算每種反應混合物的產物濃度：

A405吸光度=2.29×［pNP］（mmol/L）+0.058。

初始反應速率V0可以從Δ［Product］／Δ 時間確定，即單位時間內產品濃度的變化。所有數字保留到小數點后3 位。

表6 分析數據

問題7.Michaelis-Menten 參數（圖形估計）。

圖6 Michaelis-Menten 圖

從Michaelis-Menten 圖以圖形方式估算Vmax和Km(圖6)。在小數點后給出1 位有效數字的答案。

問題8.Lineweaver-Burk 線性函數。

圖7 是表3 中S1～S5 數據點的Lineweaver-Burk 圖（1／V0對1／［S］）。

圖7 Lineweaver-Burk 圖

確定Lineweaver-Burk 圖中線性函數（圖7），給出S1 和S5 2 個數據點小數點后的3 位有效數字，即a 和b。

1／［Vo］＝a×1／［S］+b

問題9.測定Vmax 和Km。

使用上面計算的線性函數（問題8）確定Vmax和Km。給出小數點后3 位數（不應進行單位轉換）。

問題10.反應混合物中的酶濃度。

用酶儲液濃度0.024 mg/mL 和酶的摩爾質量（75000 g/mol）計算反應混合物中的酶濃度(μmol/L)。給出小數點后3 位數。

問題11.轉化率常數。

催化速度常數kcat（1 個酶分子的反應速率）單位為1/s，計算公式如下：

計算出催化速度常數kcat，保留小數點后3 位。

2.1 抑制劑簡介

抑制劑是可以特異性結合酶的化合物，從而降低其活性并導致Km、Vmax 或兩者的明顯變化。 表觀動力學參數的變化可以從在抑制劑存在下進行的酶反應的Lineweaver-Burk 圖確定。 取決于與酶結合的方式，可逆抑制劑可以是競爭性的，非競爭性的或無競爭性的。

酶活性的抑制和動力學參數的明顯變化也可以在Michaelis-Menten 和Lineweaver-Burk 圖中顯現（圖8）。

圖8 在Michaelis-Menten 和Lineweaver-Burk 圖中的抑制酶活性

抑制劑的特征在于其抑制平衡常數Ki，其定義為

其中［I］、［E］和［EI］分別是游離抑制性劑，游離酶和酶抑制劑復合物的濃度。對于競爭性抑制，在抑制劑存在下的表觀Km 被指定為Ki。 底物

圖9

問題12.影響抑制劑的因素。

對于所有抑制類型，其抑制程度（即酶反應速率的降低）取決于（選擇下面最好的答案）：

1）抑制濃度［I］2）底物濃度［S］

3）抑制劑的Ki4）［ES］的濃度

5）1，2 和3 的狀態6）1 和3 狀態

問題13.理解抑制劑的特性。

標示出以下語句的正確或錯誤：

在競爭性抑制中，底物濃度［S］的增加會降低或克服抑制效果。

2.2 對α-半乳糖苷酶的抑制作用（27 分）

這部分實驗類似于第1 b 部分。 α-半乳糖苷酶的抑制動力學實驗將在50 μL 抑制劑的存在下進行，其濃度為0.5 mol/L。

步驟：抑制動力學實驗底物制備。

A.根據表7 準備底物，這與你在第1.2.2 部分中所做的相似。注意應通過將試管倒置5 次混合溶液。

表7 用于動力學測定的底物稀釋方案

B.使用相同的移液管吸頭將50 μL 抑制劑（I抑制劑）轉移到微量滴定板B 孔A1～A5 和B1～B5中（見圖10 和/或微量滴定板模板）。

C.將50 μL 每種最終底物溶液（表7）轉移到相同的孔位置（A1～A5 和B1～B5）。

圖10 微量滴定板B

D.將定時器設置為5 min，并在開始第1 次酶反應后立即通過將酶溶液加入到第1 孔（ISI1）中開始，如下所述。

E.從ISI1 和ISII1 開始，將50 μL 的α-半乳糖苷酶（EEnzyme）加入孔A1～A5 和B1～B5，并繼續以與ISII5 相同的順序和速度開始酶反應。

F. 孵育5 min 后，使用p200 移液器加入100 μL 終止液（Stop），按照你開始加入時的相同順序和速度終止孔A1～A5 和B1～B5 中的每個酶反應。 在加入終止液后，立即將混合物上下移動2次，徹底混勻。

問題14.酶抑制劑動力學實驗。

舉起粉紅色卡片上交你的的微量滴定板。 測量后，所得值將自動顯示在表格（同表3）中。

注意：在考試的最后10 min 內不會接受微量滴定板。

2.3 α-半乳糖苷酶抑制動力學的數據分析

在本節中，你將利用第2.1 部分的理論和第2.2 部分提供的抑制數據（表8）計算抑制劑存在下的酶動力學參數。 用于抑制數據的Lineweaver-Burk 方程將與提供的假設的Lineweaver-Burk 方程進行比較，用于推導各種抑制類型和不受抑制的反應。當你確定抑制類型時，請使用這2 個方程式來確定相關動力學參數的變化，并使用相關方程來確定抑制平衡常數（Ki）。

表8 抑制實驗的吸光度數據

問題15.抑制動力學數據分析。

計算并填寫表9。 為了以mmol/L 計算產物濃度，請使用問題6 給出的標準方程式：

吸光度A405=2.29×[pNP]（mmol/L）+0.058。

表9

依據上表中抑制動力學數據IS1～IS5，產生Lineweaver-Burk 圖。

假設不受抑制的反應的Lineweaver-Burk 方程為：1／［Vo］=0.363·1／［S］+0.9908，將該線繪制在圖11 中。 請用此方程用于下面的計算，而不是你在1.3 部分中確定的方程式（圖7）。

圖11 假設的非抑制性數據的Lineweaver-Burk 圖

問題16.線性函數（抑制反應）。

在存在抑制劑的情況下確定Lineweaver-Burk圖的線性函數（圖11），在數學上僅使用來自IS1和IS5 的數據。 a 和b 給出小數點后3 位。

1／［Vo］=a·1／［S］+b。

問題17.表觀動力學參數與抑制劑。

在抑制反應的Lineweaver-Burk 圖中確定存在抑制劑的表觀動力學參數。 給出小數點后3 位數（不需要進行單位轉換）。

問題18.確定抑制類型。

抑制劑對α-半乳糖苷酶有什么抑制作用？ 與抑制酶的假設數據相比，基于抑制劑存在的動力學參數變化的大小，選擇最可能的抑制類型：

1）競爭性2）非競爭性3）不確定

問題19.底物濃度的影響。

根據你以上選擇的抑制類型，底物濃度的增加如何影響抑制？ 選擇出正確答案：

1）抑制減弱2）無變化3）抑制增強

問題20.抑制常數。

如果添加到反應混合物中的50 μL 抑制劑的濃度為0.5 mol/L，則確定抑制常數（Ki）。 在小數點保留3 位數字（在此計算中不進行單位轉換）。

考試結束。

（第26 屆試題完）