小麥中嘔吐毒素不同檢測方法的對比研究

吳藝影 應玲紅 盛林霞 陳舒萍

【摘要】為了研究小麥中嘔吐毒素不同檢測方法的差異性與相關性，尋找小麥入庫作業時快速檢測法可靠性范圍，對45份小麥樣品進行膠體金試紙條、ELISA、HPLC的檢測。結果顯示：試紙條法（1000μg/kg）結果呈陰性為合格樣品，呈陽性需HPLC復檢；ELISA結果小于1000μg/kg時為合格樣品，結果為1000～1300μg/kg時需HPLC復檢，結果大于1300μg/kg為不合格樣品。

【關鍵詞】膠體金試紙條；ELISA；HPLC；小麥；嘔吐毒素

嘔吐毒素（vomitoxin），又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），由禾谷鐮刀菌產生，屬單端孢霉烯族化合物。近年來隨著氣候變化，嘔吐毒素污染糧食呈上升趨勢，尤其是小麥被污染后產量降低、品質下降，毒素難以去除。人和動物食用被污染的小麥及其制品后會對健康造成威脅，因此高效、準確地檢測出嘔吐毒素含量具有重要意義。

作為儲備糧庫，主要使用了膠體金試紙條法、酶聯免疫吸附法（ELISA）和高效液相色譜法（HPLC）等方法檢測嘔吐毒素。膠體金試紙條法簡便快速，可用肉眼進行定性分析，檢測成本低。酶聯免疫吸附法（ELISA）對樣品純度要求不高，特異性強。以上兩種方法均屬于快速檢測法，不能準確定量，易受到溫度等條件的影響，存在較大的誤差。高效液相色譜法（HPLC）定量準確，對操作人員要求高且樣品處理比較復雜，儀器昂貴、檢測成本高、花費時間長、耗費溶劑較多，不適合大批量樣品的快速檢測。

根據GB 2761-2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》要求，小麥中嘔吐毒素限量為≤1000μg/kg，糧食入庫作業時間緊、數量大，三種方法各有優勢，如何區分使用是重點。本實驗通過對快速檢測法和HPLC法檢測小麥中嘔吐毒素的結果進行比較，探索不同方法之間的差異性與相關性尋找快速檢測法可靠性范圍，合理使用快速檢測法和HPLC法，降低實驗成本，提高工作效率。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗樣品：2017年產浙江小麥20份、2015年產山東小麥25份樣品。對照樣品：嘔吐毒素含量為（1137±20%）μg/kg。

嘔吐毒素免疫親和柱，嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒，嘔吐毒素快速檢測試紙條（500～2000μg/kg）；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品，純度≥98%；甲醇、乙腈，均為色譜級；聚乙二醇（相對分子質量8000）；玻璃纖維濾紙，直徑llcm，孔徑1.5μm。

1.2儀器與設備

e2695高效液相色譜儀（配2489紫外檢測器）：美國Waters公司；HF4500酶標儀：北京華安麥科生物技術有限公司；HSE-24B固相萃取裝置：天津市恒奧科技發展有限公司；MTN-2800W氮吹濃縮裝置：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；JFSD-100粉碎機：上海嘉定糧油儀器有限公司；HY-2調速多用振蕩器：常州國華電器有限公司。

1.3實驗方法

共進行了5次實驗：每次實驗檢測9份試驗樣品、1份對照樣品，進行1次加標回收實驗。

1.3.1膠體金試紙條法

采用1000μg/kg的檢測限。稱取5.0g均質樣本于具塞三角瓶中，加入20mL蒸餾水，充分震蕩5min，靜置過濾。移取50μL濾液加入樣品稀釋液2000μL，混勻后待檢。取出已恢復至室溫的微孔試劑和試紙條，用移液器取200μL待檢液于微孔試劑中，混勻，室溫孵育4min。將試紙條浸入微孔溶液中，室溫反應5min，讀取結果。

1.3.2 ELISA法

稱取5.0g粉碎后的小麥樣品，加入25ml蒸餾水，200r/min振蕩10min，靜置3min后用定量濾紙過濾，取1ml濾液以蒸餾水1：4稀釋，手動搖勻后取50μL進行分析。取出已恢復至室溫的微孔板和液體試劑，按照說明書的要求操作點樣。

檢測參數：設定酶標儀于450nm/630nm處檢測，讀取濃度。

1.3.3 HPLC法

采用GB 5009.111-2016《食品安全國家標準食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法。

為避免樣品不均勻性導致的誤差，ELISA法和HPLC法采用同一份濾液。將濾液經玻璃纖維濾紙過濾，移取2.5ml濾液過免疫親和柱，收集洗脫液，在50～60℃條件下氮吹近干，加入1mL流動相復溶，復溶液用0.22μm微孔濾器過濾后轉移至樣品瓶，準備進樣。

色譜柱：C18柱（柱長150mm）；流動相：甲醇+水（20+80）；流速；0.8mL/min；柱溫：35℃；進樣量：50μL；檢測波長：218nm。

1.3.4加標回收實驗

為驗證前處理損失大小、檢測結果的準確性，進行了加標回收實驗，標準品添加量為1000μg/kg。

2實驗結果

2.1對照樣品檢測和加標回收實驗合國標中回收率要求，實驗結果可靠。HPLC法和ELISA法最大偏差遠低于國標（HPLC法重現性≤23%，ELISA法重現性≤25%），兩種檢測方法均重現性良好。

2.2 ELISA-HPLC結果相關性

由圖1可知，兩種方法檢測結果的一致性較高，線性相關系數R=0.984 5。ELISA試劑盒法具有較高的準確性，可以保證檢測結果的可靠性。

2.3臨界值樣品檢測結果

以HPLC檢測結果為劃分依據，對含量在臨界點附近的樣品匯總。其中，試紙條法檢測結果陰性以“一”表示，陽性以“+”表示。

由表2～表4可知，樣品DON含量<800μg/kg時，試紙條檢測結果呈陰性時，EHSA結果<1000μg/kg；樣品DON含量為800～900μg/kg時，試紙條結果呈陽性，ELISA結果在1000μg/kg上下浮動，存在誤差。樣品DON含量為900～1100μg/kg時，試紙條結果均呈陽性，ELISA在1000μg/kg上下浮動。樣品DON含量為1100～1300μg/kg時，試紙條結果均呈陽性，ELISA結果均>1000μg/kg。

3結論

試紙條法具有快速檢測、單個樣品檢測成本低等優點，樣品數量少時可優先采用此方法，以1000μg/kg為檢出限，若檢測結果呈陰性，結果可靠，判定合格。當樣品數量大，可采用ELISA法，若檢測結果<1000μg/kg，判定合格；若ELISA檢測結果為1000～1300μg/kg，或試紙條法呈陽性，應采用HPLC檢測法進一步檢測DON含量。當ELISA檢測結果>1300μg/kg時，可判定樣品DON含量超標。