Nec1對模擬缺氧條件下骨骼肌細胞損傷修復的作用研究

周珊瑤 陳睿 譚夕 佘燕玲 雷斯

【摘要】目的探討Necrostatin1（Nec1）在二氯化鈷（CoCl2）誘導缺氧的條件下對骨骼肌細胞損傷修復的保護作用。方法采用小鼠骨骼肌C2C12成肌細胞為體外模型，CoCl2誘導缺氧，Nec1為缺氧保護劑。將培養分化72h后的細胞分為4組，分別加入等量培養基（Control組）、200μMCoCl2（CoCl2組）、150μMNec1（Nec1組）、200μMCoCl2+150μMNec1（CoCl2+Nec1組），于光鏡下觀察不同處理組細胞的肌管形態，采用蛋白免疫印跡技術檢測肌細胞生成素（Myog）、肌細胞增強因子2A（MEF2A）蛋白表達的變化，統計細胞周期S期比例，劃痕實驗觀察細胞的損傷修復能力。結果CoCl2可誘導肌細胞形態異常，減少肌管分化，與Control組比較，CoCl2組Myog、MEF2A蛋白表達量降低（P均<001），同時，S期細胞比例下降（P<001），劃痕面積修復能力下降（P均<001）。加入Nec1干預后，細胞形態恢復，肌管分化增多，與CoCl2組比較，CoCl2+Nec1組Myog、MEF2A蛋白表達量及S期細胞比例上調（P均<005），細胞劃痕面積恢復（P<005）。結論CoCl2模擬缺氧可抑制肌細胞增殖、分化功能，導致肌細胞損傷修復能力下降。Nec1可增強缺氧條件下肌細胞的增殖和分化能力，對肌細胞的損傷修復有保護作用，可能通過抑制程序性壞死來促進肌細胞的損傷修復。

【關鍵詞】二氯化鈷；缺氧；C2C12；Necrostatin1；損傷修復

EffectofNec1onrepairofskeletalmusclecellinjuryundersimulatedhypoxiaZhouShanyao，ChenRui，TanXi，SheYanling，LeiSiGuangdongTraditionalMedicalandSportsInjuryRehabilitationResearchInstitute，GuangdongSecondProvincialGeneralHospital，Guangzhou510317，China

Correspondingauthor，ChenRui，Email：ruicmed@163com

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofNecrostatin1（Nec1）ontherepairofskeletalmusclecellinjuryundersimulatedhypoxiainducedbyCobaltouschloride（CoCl2）MethodsInthisstudy，mouseskeletalmuscleC2C12cellswereusedasaninvitromodel，CoCl2wasutilizedtoinducehypoxiaandNec1wasutilizedasahypoxicprotectiveagentFollowingcultureandisolationfor72h，thecellsweredividedinto4groups，whichweresupplementedwithanequalvolumeofculturemedium（controlgroup），200μMCoCl2（CoCl2group），150μMNec1（Nec1group），and200μMCoCl2+150μMNec1（CoCl2+Nec1group），respectivelyThemorphologyofmyotubeswasobservedunderlightmicroscopeThechangesoftheexpressionlevelsofmyogenin（Myog），myocyteenhancerfactor2A（MEF2A）proteinswerequantitativelydetectedbyWesternblottingTheproportionofcellsintheSphasewasstatisticallycalculatedWoundhealingassaywasadoptedtoevaluatetheabilityofcelldamagerepairResultsCoCl2couldinducethemyoblastabnormalitiesanddecreasedthedifferentiationofmyotubesComparedwiththecontrolgroup，theexpressionlevelsofMyogandMEF2Aproteinsweresignificantlydownregulated（bothP<001），theproportionofSphasecellsandtherepairabilityweresignificantlydecreasedintheCoCl2group（bothP<001）FollowingtheNec1intervention，thecellularmorphologywasrestoredandthedifferentiationofmyotubeswasenhancedComparedwiththeCoCl2group，theexpressionlevelsofMyogandMEF2AproteinsandtheproportionofSphasecellsweresignificantlyupregulated（bothP<005），andtheareaofcellscarwassignificantlyrestored（P<005）afterthesupplementofNec1ConclusionsCoCl2simulatedhypoxiacaninhibittheproliferationanddifferentiationofmyocytes，leadingtodecreasedabilityofcellinjuryrepairNec1canenhancetheproliferationanddifferentiationofmyocytesandprotectmyocytesfrominjuryunderhypoxicconditionsandpromotetheinjuryrepairofmyocytesbysuppressingprogrammednecrosis

【Keywords】CoCl2；Hypoxia；C2C12；Necrostatin1；Injuryrepair

氧在細胞呼吸和能量代謝中起著重要的作用。臨床上，運動性損傷、缺血缺氧性疾病或組織炎癥性改變常伴隨氧灌注不足或攝氧障礙，低氧環境可使組織功能進一步下降、甚至發生萎縮或變性壞死[12]。近年來，程序性壞死（Necroptosis）作為非凋亡的細胞死亡信號途徑成為缺血缺氧性損傷研究的新熱點，越來越多研究者發現，程序性壞死在多系統缺血缺氧性損傷后的炎癥反應、損傷修復過程中發揮重要作用[3]。相關研究表明，受體交互作用蛋白激酶1（RIP1）特異性抑制劑——壞死性凋亡抑制劑Necrostatin1（Nec1）能顯著改善缺血缺氧性損傷，對細胞、組織的增殖分化、損傷修復功能有保護作用[46]。但筆者見Nec1在骨骼肌缺氧損傷修復中作用的相關報道很少，故利用小鼠骨骼肌C2C12成肌細胞構建缺氧細胞模型，觀察缺氧對肌細胞的影響及Nec1的保護作用。

材料與方法

一、主要儀器與試劑

二氧化碳培養箱（美國ThermoFisherScientific公司），光學電子顯微鏡（美國LifeTechnologies公司），流式細胞儀（美國BeckmanCoulter公司），電泳轉印系統（北京凱元信瑞儀器有限公司），化學發光成像系統（上海天能科技有限公司）。C2C12小鼠骨骼肌細胞系購于中國科學院干細胞庫，高糖DMEM培養基（美國Gibco公司），胎牛血清、馬血清（美國Hyclone公司）。二氯化鈷（CoCl2）、Nec1（德國Sigma公司）。細胞周期檢測試劑盒、電化學發光（ECL）試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司）。肌細胞生成素（Myogenin，Myog）一抗（德國MerckMillipore公司）。肌細胞增強因子2A（MEF2A）一抗（美國CST公司）。Tubulin一抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔（美國ABclonal公司）。

二、實驗方法

1細胞培養

將C2C12小鼠骨骼肌細胞系置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，于37℃、5%二氧化碳的培養箱中進行培養，隔日換液，觀察細胞形態和生長情況。當細胞達到90%～100%融合時吸去完全培養液，使用含2%馬血清的高糖DMEM培養基進行誘導分化，隔日換液。分化72h后將細胞分為4組，分別加入等量培養基（Control組）、200μMCoCl2（CoCl2組）、150μMNec1（Nec1組）、200μMCoCl2+150μMNec1（CoCl2+Nec1組）。48h后收集細胞，進行后續實驗。

2光學顯微鏡下觀察肌管融合情況

加入CoCl2、Nec1處理48h后，在40倍光學顯微鏡下觀察細胞形態、肌管融合情況。

3細胞劃痕實驗

采用Maeker筆在培養板底部均勻劃線做標記，控制細胞數為5×105個，待細胞生長至90%時，用200μl槍頭沿標記線垂直劃痕，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，去除劃痕損傷后不貼壁的細胞，重新加入相應培養基進行培養，采用顯微鏡拍照記錄不同時間段劃痕面積，使用ImageJ軟件統計劃痕面積。

4細胞周期

用2%胰酶消化、離心、收集細胞，用PBS洗滌2次，調整細胞濃度為1×106/ml，制成單細胞懸液。加入70%冷乙醇500μl固定2h，用PBS洗去固定液，加入500μl碘化丙啶/核糖核酸酶A（PI/RNaseA）染色工作液，避光室溫孵育60min。應用PI染色法流式細胞分析不同處理下的C2C12細胞周期變化。

5蛋白免疫印跡檢測

細胞培養板中加入含蛋白酶抑制劑、磷酸蛋白酶抑制劑的細胞組織（RIPA）裂解液，于冰上裂解30min，4℃，12000轉/分離心10min。用二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白含量。取30μg蛋白，進行電泳，再將蛋白電轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫封閉1h。加入一抗于4℃孵育過夜。洗膜5次后于室溫孵育二抗。洗膜5次后，使用ECL液顯色，用天能系列全自動化學發光成像分析系統掃描成像。以Tubulin作為內參，目的蛋白條帶與內參比較作為條帶的相對表達值。

三、統計學處理

采用SPSS210對數據進行分析，同時用GraphPadPrism50進行繪圖。重復3次實驗數據，計量資料采用±s表示，正態分布的計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSDt檢驗，以P<005為差異有統計學意義。

結果

一、Nec1、CoCl2對C2C12細胞肌管形成的影響

實驗中，Control組、Nec1組肌細胞分化情況良好，可見大量長條狀肌管形成。經CoCl2處理后，分化停滯，肌管萎縮、斷裂，少見長條狀肌管形成。而加入CoCl2+Nec1處理后，可見細胞分化情況較CoCl2組改善，肌管形成增多，見圖1。

二、Nec1、CoCl2對Myog、MEF2A表達水平的影響

CoCl2處理可誘導肌生成、分化標志基因Myog、MEF2A蛋白表達下降（P均<001），加入Nec1處理后，可逆轉CoCl2的抑制作用，上調Myog（P<005）及MEF2A的表達（P<0001），見圖2、表1。

三、Nec1、CoCl2對細胞周期的影響

結果顯示，CoCl2組[（1247±106）%]和CoCl2+Nec1組[1889±352）%]S期細胞比例均較Control組[（3569±267）%]少（P均<0001），但CoCl2+Nec1組較CoCl2組多（P=0039），見圖3。

四、Nec1、CoCl2對C2C12細胞劃痕愈合的影響

實驗結果顯示，不同處理組的劃痕愈合程度不同，見圖4。隨時間推移，劃痕面積逐漸縮小，Control組、Nec1組及CoCl2+Nec1組愈合速度較快，在72h時幾乎完全愈合，而CoCl2組愈合速度相對較慢。

實驗結果采用單因素方差分析，對比各個時間點不同處理組之間的變化差異。在0h時，各處理組比較差異無統計學意義（P>005）；在24、48、72h時，CoCl2組細胞劃痕損傷面積均大于Control組、Nec1組（P均<0001）；而加入Nec1處理逆轉了CoCl2引起的細胞損傷，CoCl2+Nec1組劃痕損傷面積減小，劃痕愈合程度較CoCl2組高（P<0001），見表2、圖5。

討論

本研究采用CoCl2模擬低氧環境，觀察小鼠C2C12成肌細胞的變化。CoCl2是常用的缺氧模擬化合物，在組織中通過鈷離子競爭血紅蛋白卟啉環中的鐵離子，抑制氧合血紅蛋白的形成而喪失與氧結合的能力，在細胞中通過抑制脯氨酰羥化酶的羥化作用，從而誘發一系列類似缺氧反應，在細胞增殖、分化以及損傷應激研究中被廣泛應用[78]。

通過CoCl2模擬缺氧后，可觀察到肌細胞形態學異常，肌細胞的分化標志物Myog和MEF2A表達下調。Myog屬于生肌調節因子（MRF）家族成員，具有控制成肌細胞融合的起始，促使成肌細胞增殖，促進單核成肌細胞轉變為多核肌纖維的作用，是肌細胞終末分化的決定因素[9]。本課題組的前期研究也顯示，MRF的表達對肌細胞的分化、融合有重要的作用[10]。Myog具有堿性螺旋環螺旋（bHLH）結構，MEF2的MADSbox區域可與bHLH相互作用，從而激活Myog的表達，進而實現對骨骼肌發育的調控。本研究結果提示，CoCl2模擬缺氧可抑制肌細胞的分化。

缺氧可使多種細胞生長停滯，并使其代謝、功能和形態結構發生異常變化，并出現凋亡、壞死、自噬、程序性壞死等[78，11]。本研究結果顯示，CoCl2誘導可導致細胞周期阻滯，劃痕損傷修復能力減弱，推測缺氧對細胞增殖有抑制作用。此外，亦有文獻報道，短時間或低劑量的缺氧環境可激活細胞應激保護機制，上調血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子β1（TGFβ1）等因子的表達量，減少細胞凋亡、加速細胞增殖分化，促進修復[1213]。

近年來，程序性壞死是細胞死亡領域新的研究熱點，具有壞死的細胞形態特點和自噬的活化，主動耗損能量，且能被一系列信號傳導通路高度調控[14]。有研究表明，CoCl2誘導缺氧能使程序性壞死活化[1516]。Nec1是程序性壞死的特異性抑制劑，文獻報道Nec1可改善缺血缺氧損傷，通過抑制程序性壞死對缺血缺氧模型的腦、肝、心肌組織具有保護作用，減少病理損傷，促進組織的損傷修復，對臨床治療指導意義重大[14，1719]。本研究結果顯示，與CoCl2處理組相比，加入Nec1干預能使細胞形態恢復正常，Myog、MEF2A蛋白表達水平上調，S期細胞比例上升，劃痕實驗后的損傷面積修復能力改善，說明Nec1在缺氧條件下對骨骼肌細胞增殖分化有保護作用。由此推測，Nec1可能通過抑制肌細胞程序性壞死的發生，從而逆轉缺氧狀態對細胞增殖分化的損害。

綜上所述，CoCl2模擬缺氧可誘導肌細胞損傷，抑制其增殖、分化功能，Nec1對缺氧條件下的肌細胞損傷修復有保護作用，可能通過抑制程序性壞死來促進肌細胞的損傷修復。然而，本研究僅驗證了Nec1對化學誘導缺氧下的骨骼肌細胞具有保護作用，缺乏對物理缺氧模型的研究，未來將在后續的研究中進一步探討其在物理缺氧的體內外模型的作用，研究Nec1的藥理作用及機制，為肌組織缺氧損傷相關疾病的治療提供理論依據。

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