翹芩清肺劑對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞外信號調節激酶通路的影響

張秋玲 韓超 徐俊 楊柳 梁慧玲 楊潔穎

摘要目的：探討翹芩清肺劑在改善哮喘氣道炎癥及其可能的作用機制。方法：選取雌性SD大鼠50只，制備哮喘大鼠模型并隨機分成5組，即正常組、模型組、地塞米松組和翹芩清肺劑低、高劑量組。分別采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細胞介素1（IL1）、IL5及干擾素γ（IFNγ）的含量，并觀察肺組織病理學改變；用免疫組織化學染色法觀察細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）在肺組織內的表達，轉化生長因子（TGF）β1在支氣管組織內的表達；用實時定量聚合酶鏈反應（Realtime PCR）測定氣道平滑肌組織中ERK mRNA含量。結果：模型組中ERK蛋白含量及mRNA水平，TGFβ1蛋白表達較正常組有顯著增加（P<005）；與模型組比較，各干預組均能明顯降低ERK mRNA及TGFβ1蛋白水平（P<005）。結論：翹芩清肺劑可明顯改善哮喘大鼠的呼吸道癥狀，對氣道具有保護作用，其作用機制可能與調節IL4/IFNγ平衡失調、抑制ERK通路的磷酸化，減輕氣道炎癥有關。

關鍵詞翹芩清肺劑；氣道炎癥；ERK信號通路；轉化生長因子β1

Study on Effects of Qiaoqin Qingfei Formula on ERK Pathway in Airway Smooth Muscle Cell of Asthmatic Rat

Zhang Qiuling1， Han Chao1， Xu Jun2， Yang Liu2， Liang Huiling1， Yang Jieying1

（1 Guangzhou Hospital of Chinese Medicine， Guangzhou 510130， China； 2 School of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

AbstractObjective：To investigate the Qiaoqin Qingfei Formula in improving airway inflammation and its possible mechanism. Methods：Fifty female SD rats with asthma were randomly divided into 5 groups：normal group， model group， dexamethasone group and， low and high dose group of Qiaoqin Qingfei Formula. The contents of interleukin1 （IL1）， interleukin5 （IL5） and interferon gamma （IFNγ） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected with ELISA method after administration. The proteins expression of the Erk1/2 of the lung tissues and the TGFβ1 of the bronchial tissues were analyzed by Western blot method and the mRNA expression of ERK1/2 of the bronchial tissues were analyzed by Realtime PCR. Results：Compared with normal group， the mRNA expression of ERK and the protein expression of TGFβ1 were significantly increased （P<001）. Compared with the model group， all the treatment groups significantly decreased the expression of the ERK mRNA and the protein of TGFβ1 （P<005001）. Conclusion：Qiaoqin Qingfei Formula can significantly improve the symptoms of respiratory tract which has a protective effect on asthmatic rats. Its mechanism may be related to the inhibition of the phosphorylation of ERK signaling pathway， regulation of IL4/IFNγimbalance and reduction of inflammatory cell infiltration.

Key WordsQiaoqin Qingfei Formula； Airway inflammation； ERK signal pathways； TGFβ

中圖分類號：R2895文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.037

支氣管哮喘（哮喘）是由肥大細胞、嗜酸性粒細胞等多種炎性反應細胞參與的以慢性氣道炎性反應和氣道高反應性為特征的慢性呼吸道系統疾病。細胞外信號調節激酶（Extracellularsignal Regulated Kinase，ERK）是絲裂原活化激酶（MAPKs）家族中的重要成員之一，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生理病理過程，作為一個重要的第二信號轉導通路，參與了哮喘氣道慢性炎性反應、氣道高反應性（AHR）和氣道平滑肌的增殖等多種病理生理過程[12]。近年來國內外有關ERK通路在哮喘發病機制中作用已成為研究熱點之一。翹芩清肺劑為我院呼吸內科總結多年臨床經驗所擬的驗方，并制成院內制劑臨床使用20余年，治療急慢性支氣管炎臨床療效顯著，深受廣大病患歡迎。研究發現，其在防治哮喘方面也有良好效果。本研究擬通過卵清蛋白（OVA）誘導大鼠制備哮喘的動物病理模型，觀察翹芩清肺劑對大鼠氣道炎癥的影響及初步探討其可能的作用機制，現報道如下。

1材料與方法

11材料

111動物選取SPF級SD大鼠50只，雌性，6～8周齡，體重150～180 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供（實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）20130002）。實驗動物許可證號：SCXK（粵）20122017。實驗室常規飼養條件20～25 ℃室溫，自由飲食。

112藥物翹芩清肺劑（下簡稱翹芩，由廣州市中醫醫院制備，25 kg生藥量/L）；地塞米松（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：140692）。

113試劑與儀器Sigma卵清雞白蛋白（OVA）（USA，批號：A5253）；生理鹽水（常州蘭陵制藥有限公司，批號：H52020069）；氫氧化鋁干粉（廣州化學試劑廠，批號：201912012）；8%和10%免疫印跡預制膠（弗德生物有限公司，批號：20150501）；TGFβ抗體（Cell Signaling，批號：3711S）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0012S）；RIPA蛋白裂解液（武漢博士德生物技術有限公司，批號：10C09A05）；IFNγ、IL4、IL5檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Western Blotting Luminol Reagent（PIERCE）；預染蛋白質Marker（Fermentas）；PrimeScriptR RT reagent Kit、SYBRR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）；PVDF膜（BioRad）；RNAiso Plus（Takara寶生物工程（大連）有限公司，批號：AA16071）；曝光膠片（富士）；蛋白酶抑制劑混合物（Cocktail，100×）；APS、TEMED（SigmaAldrich）；Tween20（Aresco）；其余試劑均為國產分析純以上。

JJ12J型脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；402AI型超聲霧化器（魚躍股份有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；JBP5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；KDP型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；JBL5型凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；ISRDD3型恒溫振蕩器（美國Crystal Technology公司）；M114型顯微鏡（OPTIKA）；ST16R型高速冷凍離心機（美國Thermo Sorvall公司）；凝膠電泳、電轉儀（美國BioRAD公司）；PB602L型電子分析天平（瑞士METTLER公司）；UV7504型單光束紫外可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；Safire2型全波長多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）。

12方法

121分組與模型制備隨機選取50只大鼠，經7 d適應性飼養后，采用文獻[34]方法制備哮喘模型。適應性飼養1周后，按大鼠體重隨機分成5組：對照組、模型組、地塞米松組、翹芩高劑量組和低劑量組，每組10只。模型及藥物組大鼠在實驗第1、8天分別腹腔注射10%卵清蛋白（OVA）混懸液1 mL致敏，正常組給予生理鹽水腹腔注射1 mL。從第15天起，將大鼠置于密閉有機玻璃箱中用超聲霧化器噴霧，任大鼠自行吸入，進行激發造模。每次噴霧1% OVA混懸液（正常組用生理鹽水代替）。1次/d，30 min/次，連續2周。

122給藥方法自大鼠首次致敏第2天開始，各組動物均以相應藥物灌胃。第15天開始在給藥30 min后進行激發，（地塞米松組自第15天后，隔天給藥）；1次/d，共4周：正常組：生理鹽水5 mL/（kg·d）；模型組：生理鹽水5 mL/（kg·d）；地塞米松組：027 mg/（kg·d）；翹芩高劑量組：26 g/（kg·d）；翹芩低劑量：65 g/（kg·d）。

123標本采集及相關檢測連續給藥2周后，于末次激發后24 h內進行腹腔麻醉（4%戊巴妥鈉，1 mL/kg體重）取材：1）肺泡灌洗液（BALF）：打開大鼠胸腔后，選取右肺進行支氣管肺泡灌洗術，把09%氯化鈉注射液5 mL，以25 mL/次注入氣管內，緩慢反復抽吸，將灌洗液留取3～4 mL，于4 ℃、2 000 r/min離心15 min，取上清液用于白細胞介素4（IL4）、白細胞介素5（IL5）及干擾素γ（IFNγ）的含量測定，具體步驟按酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒說明操作。2）肺組織：迅速打開大鼠胸腔，分離肺組織，以10%甲醛固定24 h，常規脫水，石蠟包埋切片。3）氣道組織：打開頸部皮膚，分離氣管，切取氣管至支氣管段，冰凍切片，以10%甲醛內固定24 h，常規石蠟切片。

1231肺組織病理觀察左上葉肺組織切片，蘇木精伊紅（HE）染色后于鏡下觀察肺部病理變化。

1232免疫組織化學技術檢測肺中ERK1/2及氣道中轉化生長因子（TGF）β蛋白的表達檢測步驟按說明書進行，依次為肺組織石蠟切片常規脫蠟至水，抗原修復，冷卻后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH74）洗滌，置于H2O2溶液（3%）中避光室溫孵育，用PBS洗滌以消除內源性過氧化物酶活性。切片甩干，滴加牛血清白蛋白（BSA）（3%）后室溫封閉10 min，PBS洗滌，滴加一抗，孵育后再滴加二抗，PBS洗滌，洗滌，顯色，復染細胞核，DW洗滌后脫水封片。

1233氣道組織ERK1/2 mRNA表達的檢測用于實時PCR實驗的引物序列如下表1所示。

取樣品（剪取每組肺組織約30 mg）剪碎，冷凍研磨，用Trizol一步法提取總RNA，按相應試劑盒操作說明書進行逆轉錄。逆轉錄反應（37 ℃，30 min）；令逆轉錄酶失活（85 ℃，10 s）；95 ℃，30 s（預變性）；PCR反應（95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，共40個循環）；解離（95 ℃，15 s；60 ℃，60 s）；溶解曲線（65 ℃下30 s）。

實時PCR擴增后，確認融解及擴增曲線良好，運用△△ct法對數據進行統計分析。

13統計學方法采用SPSS 130統計軟件進行分析，所有實驗數據均以（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，以P<005為差異有統計學意義。

2結果

21翹芩清肺劑對氣道炎癥及肺部病理變化的影響模型組肺泡間質明顯增厚并伴隨大量淋巴細胞浸潤，支氣管杯狀細胞明顯增殖，部分見脫落，固有層明顯增厚并淋巴浸潤明顯，黏膜層明顯增厚并纖維化，可見部分黏液腺增生；血管黏膜層纖維性增生；血管支氣管管腔中可見黏液滲出形成黏液栓。各藥物干預組固有層增厚程度較輕，黏膜層增厚較模型組減輕。其中，地塞米松組支氣管結構完整，管徑正常，管壁細胞排列紊亂，管周有少量炎性反應細胞浸潤，上皮細胞及杯狀細胞增殖減少；翹芩清肺劑組支氣管黏膜上皮細胞及杯狀細胞的增殖減少，支氣管稍變形，炎性反應細胞浸潤明顯減少，管壁及平滑肌厚度明顯減小，以上改變隨翹芩清肺劑劑量的加大而減輕。對照組肺組織形態結構清晰完整，氣管杯狀細胞無明顯增殖及脫落，血管結構完整，周圍無明顯炎性反應細胞浸潤。見圖1AE。

22翹芩清肺劑對支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL4、IL5及IFNγ水平的影響與對照組比較，模型組BALF中IL4、IL5的表達水平明顯增加，IFNγ表達水平明顯下降（P<005）。與模型組比較，經藥物干預后，各藥物組均能顯著降低IL4的表達及IL4/IFNγ的比值（P<005）。其中，翹芩清肺劑降低IL4表達的作用隨著劑量加大而增強。翹芩清肺劑高劑量組及地塞米松組均可明顯降低IL5水平（P<005），IFNγ水平增加（P<005），但翹芩清肺劑低劑量組則對其無明顯影響（P>005）。見表2。

組織中的pERK1/2及氣道組織中TGFβ1的蛋白表達明顯增高（P<005）；地塞米松組相對于模型組肺組織中pERK1/2的蛋白表達顯著下降（P<0005）；翹芩組相對于模型組pERK1/2蛋白表達均有下降趨勢，但差異無統計學意義（P>005）。藥物組中的TGFβ1蛋白表達均有明顯降低（P<005）；翹芩組降低TGFβ1蛋白表達的作用略優于地塞米松組，且隨劑量的增加作用有所增大，但藥物組間差異無統計學意義（P>005）。見圖2、3（AE）、表3。

34翹芩清肺劑對氣道組織中ERK1/2 mRNA表達的影響與對照組比較，模型組的ERK1/2 mRNA含量顯著增多（P<005）；與模型組比較，各藥物組均能明顯降差異低ERK1/2 mRNA的表達（P<005）；其中以翹芩高劑量組作用為最優，與翹芩低劑量組比較，差異有統計學意義（P<005）。見圖4。

3討論

哮喘是由多種炎性反應遞質和多種炎性反應細胞參與的慢性氣道炎癥，有研究者認為，氣道重塑可能與氣道炎癥并存，并進一步導致慢性炎癥的發生和持續存在[5]，其中氣道平滑肌細胞增殖肥大占有重要地位。TGFβ1是目前發現的活性最強的促氣道纖維化因子，氣道平滑肌在TGFβ1的刺激下，可誘發細胞炎性反應遞質高分泌及收縮蛋白合成增加等，進而出現氣道重塑、氣道高反應性等一系列表現[67]。在哮喘發病過程中，以TGFβ為代表的細胞因子表達紊亂，從而激活相關信號通路，影響細胞的屏障功能是哮喘重要的病理機制之一，也是導致隨后發生的氣道高反應性、氣道重塑的一個重要環節。

目前發現ERK在氣道平滑肌上廣泛分布并主要以ERK1、ERK2 2種亞型存在。ERK1/2的磷酸化表示ERK信號通路被激活，其磷酸化的一系列底物可激活多種效應蛋白，并廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生理病理過程。研究結果表明ERK通路與哮喘發病機制過程密切相關，并參與了哮喘氣道高反應性、氣道慢性炎癥等的發生、發展[12]。據此，本實驗我們觀察了翹芩清肺劑對ERK通路的影響，以期探討翹芩清肺劑改善哮喘氣道炎性反應可能的作用機制。

翹芩清肺劑為我院臨床應用20余年的院內純中藥復方制劑，療效確切，無明顯不良反應。方中主要成分為連翹、黃芩、板藍根、荊芥、杏仁等，全方清肺化痰，疏風清熱。目前我們研究已證實，翹芩清肺劑對OVA誘導的大鼠哮喘發作具有抑制作用，可與臨床療效相印證。研究結果顯示，翹芩清肺劑可明顯地改善氣道炎性反應，減輕支氣管細胞增殖及平滑肌增厚，其作用機制可能與降低哮喘時過高的PAF與ET表達，糾正了Th1/Th2失衡有關[67]。

從本實驗結果可見，相對于對照組，ERK1/2、TGFβ1蛋白的表達、BALF液中的IL4、IL5表達在模型組中顯著增高，IFNγ表達則明顯降低；用藥后，各藥物組均能明顯降低病鼠肺中ERK1/2 mRNA及氣道中TGFβ1的表達水平；其中翹芩清肺劑高劑量組、翹芩清肺劑低劑量組降低ERK1/2 mRNA及TGFβ1表達的作用與地塞米松組相當；翹芩清肺劑低劑量組降低TGFβ1的蛋白表達效果與高劑量組相當。各藥物組均能降低IL4的含量及IL4/IFNγ的比值。其中地塞米松組及翹芩清肺劑高劑量組可明顯降低IL5的表達，增加IFNγ的表達，而翹芩清肺劑低劑量組對其則無明顯作用。

其中，ERK的氣道表達的放免及PCR結果表明，翹芩清肺劑可明顯降低ERK mRNA的表達，而放免結果雖ERK的蛋白表達均有所下降，但比較無統計學意義。由此推測，翹芩清肺劑可顯著抑制ERK1/2 mRNA復制和（或）DNA轉錄，而ERK的蛋白合成因遲于RNA和DNA的復制和轉錄，故未見ERK蛋白表達的差異顯著性。由此說明，擬觀察翹芩清肺劑對哮喘ERK蛋白變化的影響，需要更長的時間。

綜上所述，我們認為，翹芩清肺劑防治哮喘的作用可能是通過降低TGFβ1的表達，下調pERK1/2 mRNA水平，調節ERK信號通路的傳導，減輕氣道纖維化及氣道平滑肌細胞的增殖，減緩炎性反應的發生發展等而實現的。

參考文獻

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（2018-04-18收稿責任編輯：楊覺雄）