秦皮乙素抑制多柔比星毒性的分子機制研究

李瀟 徐繁 房亮 張圣林 姜海軍 趙博

【摘要】目的探討秦皮乙素（Esc）對多柔比星（DOX）誘導的H9C2細胞損傷的保護作用及機制。方法培養H9C2心肌細胞并分為空白組、DOX組、Esc+DOX組，透射電鏡觀察各組細胞超微結構，蛋白免疫印跡法檢測各組Bmi1的表達情況。將細胞重新分為3組：DOX組，空白siRNA轉染組（Esc+DOX+NC siRNA）和Bmi1 siRNA轉染組（Esc+DOX+Bmi1 siRNA），蛋白免疫印跡法檢測各組Bmi1的表達情況，流式細胞術檢測細胞凋亡情況和細胞內活性氧（ROS）的含量。結果DOX組細胞腫脹、線粒體嵴斷裂，Bmi1表達低于Esc+DOX組（P<001）；Bmi1 siRNA轉染組H9C2細胞凋亡數量、ROS含量高于空白siRNA組（P均<001），Bmi1表達低于空白siRNA轉染組（P<001）。結論秦皮乙素可減輕多柔比星誘導H9C2細胞的凋亡，其作用機制可能與抑制Bmi1表達，從而調節線粒體功能及減少ROS的產生有關。

【關鍵詞】多柔比星；秦皮乙素；線粒體；Bmi1

Molecular mechanism of the effect of esculetin on relieving doxorubicin toxicityLi Xiao， Xu Fan， Fang Liang，Zhang Shenglin， Jiang Haijun，Zhao BoAffiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，China

Corresponding author，Xu Fan，Email：28574060@qqcom

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of esculetin （Esc） on doxorubicin（DOX）induced injury in H9C2 cells MethodsH9C2 myocardiac cells were cultured and divided into the control， DOX and Esc+DOX groups The ultrastructure of the cells in each group was observed by transmission electron microscope The expression of Bmi1 in each group was detected by western blot The cells were then divided into three groups： DOX， Esc+DOX+NC siRNA and Esc+DOX+Bmi1 siRNA groups Western blot was used to detect the expression of Bmi1 in each group The cellular apoptosis and the content of intracellular reactive oxygen species （ROS） were detected by flow cytometry ResultsIn the DOX group， cell swelling and mitochondrial cristae breakeage were observed and the expression of Bmi1 was significantly lower than that in the Esc+DOX group （P<001） In the Esc+DOX+Bmi1 siRNA group， the quantity of apoptotic cells and the content of ROS were significantly higher than that in the Esc+DOX+NC siRNA group（both P<001）， and the expression of Bmi1 was significantly lower than that in the Esc+DOX+NC siRNA group （P<001） ConclusionsEsc can mitigate the DOXinduced injury in the H9C2 cells The underlying mechanism is probably correlated with the downregulated expression level of Bmi1， thereby modulating the mitochondrial function and reducing the production of ROS

【Key words】Doxorubicin； Esculetin； Mitochondria； Bmi1

多柔比星為蒽環類抗生素，具有廣譜抗腫瘤作用，但其對正常細胞（心臟、肝臟、腎臟等細胞）具有毒性作用，嚴重制約多柔比星的臨床應用[1]。有研究表明，當多柔比星的累積總量大于600 mg/m2時，心力衰竭的發生率達36%[2]。多柔比星誘導心臟毒性的機制比較復雜，包括刺激自由基形成增加、線粒體損傷、細胞凋亡等，其對正常細胞的毒性主要為線粒體功能破壞、線粒體損傷[3]。秦皮乙素是中藥秦皮的主要活性成分，可清除氧自由基、保護細胞免受過氧化物造成的損傷，之前已有研究證實Bmi1基因在DNA損傷應答、維持線粒體功能和活性氧（ROS）平衡過程中發揮重要的作用[4]。在本研究中我們首次探究了秦皮乙素對H9C2細胞內Bmi1表達的調節作用，以探討秦皮乙素保護多柔比星致心肌細胞損傷的可能機制。

材料與方法

一、材料

大鼠胚胎心肌細胞H9C2，來源于中國科學院細胞庫。RPMI1640培養基（貨號：SH3080901B）和胎牛血清（FBS貨號：SV3008703），購于HyClone Laboratories公司（美國）；GAPDH的一抗（兔多抗，貨號：104941AP）、二抗（羊抗兔IgG HRP抗體，貨號：104941AP）購于Proteintech公司（中國武漢）；Bmi1 siRNA（貨號：6442S ）和NC siRNA（貨號：abx918119 ）均來自生興生物公司（中國南京）；DCFHDA（貨號：D6470）購于Invitrogen公司（美國）；多柔比星（貨號：ASD807）、秦皮乙素（貨號：YMWS1229）購于阿拉丁生物化學技術有限公司（中國上海）。

二、細胞培養及分組

H9C2細胞用含有10% FBS的RPMI1640培養基于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，當細胞覆蓋培養瓶底部的80%時，使用胰蛋白酶消化以制備單細胞懸液。然后將H9C2細胞接種到96孔板，調整細胞濃度為5×104個/ml，細胞分為3組：空白組（Control）、多柔比星（DOX）組、秦皮乙素（Esc+DOX）組。空白組細胞只加培養基，秦皮乙素組細胞加入10 μmol/L秦皮乙素培養2 h[5]；然后在Dox和Esc+Dox組細胞加入8 μmol/L多柔比星繼續培養48 h，收集細胞待用。

三、透射電子顯徼鏡觀察線粒體結

收集各組細胞，加入25%戊二醛在4 ℃的冰箱中固定48 h；再用1%四氧化鋨在4 ℃固定30 min；用系列丙酮在室溫下脫水；然后用包埋劑包埋，用超薄切片機切片并染色，透射電子顯微鏡檢測線粒體結構改變。

四、Bmi1在H9C2細胞中的表達及其對細胞損傷的影響

1通過胰蛋白酶消化收集各組細胞

使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠將細胞抗原按分子量大小分離，濕式轉膜將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，分別加入Bmi1、GAPDH一抗（用一抗稀釋液將一抗按照1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜，再分別加入二抗（用二抗稀釋液將二抗按照1∶2 000稀釋）室溫下2 h，在暗室中將ECL發光液覆蓋于膜表面，用化學發光熒光影像分析儀進行曝光，檢測各組Bmi1的表達。

2實驗細胞分組

將細胞重新分為3組：DOX組、空白siRNA轉染組（Esc+DOX+NC siRNA）和Bmi1 siRNA轉染組（Esc+DOX+Bmi1 siRNA）。將300 pmol Bmi1 siRNA和300 pmol空白siRNA加入到2 ml無血清OptiMEM I培養基中，將LipofectamineTM RNAiMAX加入（20 μl）至2種溶液中，然后充分混合并加入細胞中。孵育48 h后，通過蛋白免疫印跡法檢測每組Bmi1的表達；然后用流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況；在每組細胞中加入10 μmol/L DCFHDA染色溶液，37℃避光孵育20 min，采用流式細胞儀檢測各組細胞ROS的水平。

五、統計學處理

使用SPSS 190進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey法，P<005為差異具有統計學意義。

結果

一、秦皮乙素可減輕多柔比星誘導的H9C2細胞毒性線粒體功能紊亂

電鏡結果顯示，DOX組出現H9C2細胞腫脹，線粒體嵴發生破裂。在Esc+DOX組中，H9C2細胞保持正常完整的線粒體（圖1）。

二、秦皮乙素對多柔比星誘導的H9C2細胞Bmi1表達和細胞損傷的影響

蛋白免疫印跡分析表明，與DOX組相比，Esc+DOX組內Bmi1表達增加（圖2A）。在敲除Bmi1后，與空白siRNA組相比，Bmi1 siRNA組中的Bmi1蛋白表達降低（圖2B），細胞凋亡率升高（圖2C），ROS水平升高（圖2D）。因此，秦皮乙素對多柔比星誘導的心肌細胞損傷的作用機制是上調Bmi1的表達。

討論

多柔比星是抗腫瘤譜廣、活性強、在國內外被廣泛使用的抗腫瘤藥物。但長期使用時，由于劑量累積作用，存在嚴重的毒副反應，尤其是骨髓與心臟的毒性，大大限制了多柔比星的應用。多柔比星產生心臟毒性的機制很多，包括線粒體功能紊亂、ROS水平增高等[6]。本研究結果表明多柔比星會使線粒體的形態發生改變，增加了H9C2細胞內

Bmi1基因是多梳基因家族PcG的重要成員之一，由多種轉錄抑制因子組成，以多蛋白復合體的形式調控靶基因的表達，在細胞的增殖能力、細胞周期及細胞凋亡等生命現象中發揮著重要作用[7]。近來研究顯示，Bmi1也在多種惡性腫瘤異常表達，包括乳腺癌、宮頸癌和肺癌等，與腫瘤的生物學特性和患者的預后轉歸密切相關，被認為是一種新的腫瘤標志物和潛在的治療靶點[8]。Bmi1通過調節與線粒體功能和ROS產生相關的基因表達來調節線粒體功能。研究顯示Bmi1基因缺失的細胞線粒體功能遭到了破壞，ROS水平升高，說明Bmi1可以直接調節細胞內氧化壓力[9]。

本研究表明，秦皮乙素可以抑制多柔比星導致的Bmi1表達減少，從而調節線粒體功能及減少ROS的產生，減輕多柔比星對心肌細胞的毒性。有研究表明，Bmi1是miRNA132的下游靶基因，過表達miRNA132之后，可抑制Bmi1 的表達[10]。秦皮乙素減輕多柔比星致心臟毒性的其他機制尚需深入探討，但本研究可為相關臨床研究提供實驗依據。

參考文獻

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（收稿日期：20171206）

（本文編輯：楊江瑜）