植物原生質(zhì)體融合方法的研究進(jìn)展

李琦

摘 要：原生質(zhì)體融合（protoplast fusion）是指通過物理或化學(xué)方法使兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，經(jīng)培養(yǎng)獲得具有雙親全部或部分遺傳物質(zhì)后代的方法。應(yīng)用植物原生質(zhì)體融合技術(shù)，可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，打破物種之間的生殖隔離，擴(kuò)大雜交親本范圍，實(shí)現(xiàn)基因在物種間的轉(zhuǎn)移和遺傳重組，培育新品種和創(chuàng)造新物種。主要就植物原生質(zhì)體融合的方法進(jìn)行了闡述。

關(guān)鍵詞：植物原生質(zhì)體；融合方法；研究進(jìn)展

文章編號(hào)： 1005-2690（2018）06-0038-02 中圖分類號(hào)： Q943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

原生質(zhì)體是組成細(xì)胞的一個(gè)形態(tài)結(jié)構(gòu)單位，原生質(zhì)體是指被去掉了細(xì)胞壁后的被細(xì)胞膜包圍的“裸露細(xì)胞”，是開展基礎(chǔ)研究的主要材料。1960年英國科學(xué)家Cocking第一次用酶法大量制備原生質(zhì)體，Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根組織中加入可降解細(xì)胞壁的等滲酶液，在一定條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞的細(xì)胞壁被降解，從而制備出大量有活力的原生質(zhì)體。

1 原生質(zhì)體融合的目的及意義

原生質(zhì)體融合技術(shù)可克服不同原生質(zhì)體間的排斥力，使兩種不同種屬的原生質(zhì)體間發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，進(jìn)而形成具有含兩種遺傳物質(zhì)的雜交細(xì)胞，克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性和子代不育等障礙。另外，可轉(zhuǎn)移優(yōu)良的生物性狀，實(shí)現(xiàn)基因重組，而改良現(xiàn)有品種。目前原生質(zhì)體融合所改良的目標(biāo)性狀包括抗凍、抗干旱、抗病毒、抗蟲、耐高鹽等，還可按照人們預(yù)先的期望創(chuàng)造出新物種。

2 原生質(zhì)體的融合方法

2.1 自發(fā)融合

在酶解細(xì)胞壁形成原生質(zhì)體的過程中，相鄰的原生質(zhì)體會(huì)因細(xì)胞間胞間連絲的擴(kuò)展和粘連而彼此融合形成同核體（homokaryon）。每個(gè)同核體內(nèi)可包含兩個(gè)或多個(gè)核，這種類型原生質(zhì)體的融合被稱作為自發(fā)融合。多核融合體常出現(xiàn)在植物幼嫩葉片或分裂旺盛的培養(yǎng)細(xì)胞制備的原生質(zhì)體中。如在玉米胚乳愈傷組織細(xì)胞和玉米胚懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體中，大約有50%是多核融合體。

2.2 高pH-高Ca2+法

通常情況下，Ca2+影響細(xì)胞融合的效率比Na+和K+ 要低，但是在高pH環(huán)境下，高濃度的Ca2+影響細(xì)胞融合的效率大大升高。該法以鈣鹽作誘導(dǎo)劑，在高Ca2+高pH的條件下，使原生質(zhì)體發(fā)生融合。該種方法在1973年是由Keller和Melchers進(jìn)行誘導(dǎo)煙草原生質(zhì)體融合時(shí)創(chuàng)造的。具體是將兩個(gè)原生質(zhì)體的混合物放于含有7.35 g/L CaCl2·2H2O和72.87 g/L甘露醇的溶液中，pH值為10.5，在200 rpm/min低速下離心3 min，然后將離心管保持在37 ℃水浴鍋中40～50 min。但這種方法僅適合葉肉原生質(zhì)體的融合，并且要注意高pH環(huán)境對(duì)某些細(xì)胞生理活性產(chǎn)生的影響。

2.3 聚乙二醇（PEG）法

PEG是一種大分子量的水溶性多聚化合物。采用PEG法，需將兩種不同的原生質(zhì)體以合適比例混合后，加入28%～58%的PEG溶液處理15～30 min，然后用培養(yǎng)基進(jìn)行清洗后即可培養(yǎng)。后來有學(xué)者對(duì)PEG法進(jìn)行了改進(jìn)，即逐步降低PEG的濃度，提高溶液中Ca2+的濃度和pH值，使融合效果得到有效的提高。由于該法易于控制、操作簡單、促進(jìn)細(xì)胞融合的能力較強(qiáng)、誘導(dǎo)的融合沒有特異性，故被廣泛選用。

2.4 電融合法

電融合法是指用細(xì)胞融合儀產(chǎn)生交變電壓和高壓脈沖電場，使粘連的原生質(zhì)體膜瞬間破裂，然后與相鄰的不同原生質(zhì)體連接閉合產(chǎn)生融合體。黃家總等成功地利用電擊細(xì)胞融合，使紫羅蘭和桂竹香的原生質(zhì)體融合。該種方法的優(yōu)點(diǎn)是沒有化學(xué)殘留、對(duì)細(xì)胞的毒害作用較小、操作簡單、融合率高、一次可融合大量原生質(zhì)體。

2.5 激光微束穿刺法

激光微束穿刺法是利用聚焦到微米級(jí)的激光微束對(duì)組織進(jìn)行穿刺，引起細(xì)胞膜的可逆性穿孔，從而導(dǎo)入外源DNA的一種基因直接轉(zhuǎn)化方法。侯丙凱等首次用激光微束穿刺法照射油菜子葉葉柄，將殺蟲蛋白基因?qū)胗筒耍?jīng)植物再生和卡那霉素篩選，成功獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因植株。此法對(duì)細(xì)胞的損傷較小，并且可以準(zhǔn)確定位于被照射的細(xì)胞，但是因設(shè)備昂貴，故在大量培養(yǎng)生產(chǎn)中使用較少。

2.6 亞原生質(zhì)體融合

植物亞原生質(zhì)體主要包括3種，分別是核質(zhì)體、胞質(zhì)體和微原生質(zhì)體，其中最常用的是胞質(zhì)體和微原生質(zhì)體。胞質(zhì)體-原生質(zhì)體融合被認(rèn)為是獲得胞質(zhì)雜種、轉(zhuǎn)移胞質(zhì)因子最為有效的方法。如Sigareva等將大白菜原生質(zhì)體與抗寒且具有Ogura型CMS特性的花椰菜胞質(zhì)體融合，獲得的胞質(zhì)雜種具有抗寒與胞質(zhì)雄性不育的特性，與傳統(tǒng)方法相比，此法育種過程較短，生產(chǎn)效率更高。另外，微原生質(zhì)體-原生質(zhì)體融合也被稱為微核技術(shù)，是指將供體原生質(zhì)體經(jīng)處理后僅含有一條或幾條染色體，用膜包被后與另一完整原生質(zhì)體融合的技術(shù)。Ramulu等利用該技術(shù)在茄科不同屬植物間完成了目標(biāo)染色體的轉(zhuǎn)移，并成功獲得植株。該技術(shù)雖可在不同種屬間轉(zhuǎn)移一條或多條染色體，并獲得性狀穩(wěn)定的再生植株，但制備微原生質(zhì)體的難度較大，因此該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。

3 展望

除上述植物原生質(zhì)體融合方法外，還包括植物介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法、鹽類融合法、多聚化合物法、PEG-高Ca2+-高pH融合法，目前發(fā)展的如高通量細(xì)胞融合芯片方法和基于微流控芯片進(jìn)行融合法。關(guān)于對(duì)植物原生質(zhì)體融合方法的研究，是許多學(xué)者的研究對(duì)象，相信將來如果在原生質(zhì)體融合效率和成本控制、多個(gè)原生質(zhì)體間的融合與如何將優(yōu)良性狀基因精準(zhǔn)地導(dǎo)入植物細(xì)胞融合方面取得進(jìn)展，植物原生質(zhì)體融合會(huì)起到更加重要的作用，創(chuàng)造更大的價(jià)值。

（收稿日期：2018-05-08）