DNA甲基化與肺動脈高壓患病風險相關性的研究進展

朱才民　李旎　孫樂波　鄭大為　石活順　徐國棟　邵國豐

【摘要】 肺動脈高壓是一種嚴重而無法治愈的肺血管疾病，其發病機制復雜。DNA甲基化是在甲基化轉移酶的作用下調控基因選擇性轉錄表達的表觀遺傳學修飾。近期研究發現，DNA甲基化在肺動脈高壓的發生、發展過程中起著重要作用。該文就近年來對DNA甲基化影響肺動脈高壓形成的研究作一綜述。

【關鍵詞】 肺動脈高壓；DNA甲基化；基因；表觀遺傳學

【Abstract】 Pulmonary arterial hypertension is a serious and incurable pulmonary vascular disease with complex pathogenesis. DNA methylation is an epigenetic modification that electively regulates the transcriptional expression of genes under the action of methyltransferase. Recent studies have demonstrated that DNA methylation plays a crucial role in the incidence and progression of pulmonary arterial hypertension. This review summarizes recent studies focusing upon the effect of DNA methylation on the incidence of pulmonary arterial hypertension.

【Key words】 Pulmonary arterial hypertension； DNA methylation； Gene； Epigenetics

肺動脈高壓（PAH）是以肺血管阻力進行性升高，肺動脈平均壓力升高為其特性的一種病理生理狀態，最終致使患者右心功能衰竭而死亡，且發病以女性為主，女∶ 男比例約為2.3∶ 1，若未及時診斷并積極干預，患者一般在出現癥狀后2～3年內死亡[1-2]。血流動力學診斷標準為：在海平面、靜息狀態下，右心導管測量mPAP≥25 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）[3-4]。PAH分為原發性和繼發性兩類。原發性肺動脈高壓（PPH）是目前原因不明的肺動脈高壓，屬致命性PAH，是一種少見疾病，包括特發性肺動脈高壓（IPAH）與家族性肺動脈高壓（FPAH）。繼發性PAH可發生于重癥慢性肺部疾病、心臟瓣膜病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）、先天性心臟病、風濕性心臟病、艾滋病等，除有PAH的表現外，還有原發病的表現，繼發性肺動脈高壓較常見[5]。雖然近年來隨著靶向藥物上市及臨床診療路徑的規范使得PAH患者生存率有所提高，但從長期看，預后仍不容樂觀。

大量研究結果表明，PAH的發生是遺傳因素和環境因素共同作用的結果，而表觀遺傳學正是從遺傳-環境交互作用的角度來探討疾病的發生[6-7]。目前對PAH進行DNA甲基化方面的研究很少。然而在其他領域比如癌癥研究中卻十分常見，比如DNA甲基化作為核酸類的腫瘤標記物，在胰腺癌的診斷方面具有明顯優勢已被證實[8]。這些說明在PAH領域中，亟需開展表觀遺傳學方面的研究。隨著遺傳學技術進步，有關PAH的易感基因和致病基因被陸續發現。近年來對IPAH的發病機制研究不斷深入，最為重要的進展即在分子遺傳方面發現PAH具有易感性。另外，PAH體外肺動脈內皮細胞培養表現為高增殖活性，抗凋亡傾向，與腫瘤發生機制相似，PAH可能是由于肺血管細胞遺傳學改變所致[9]。

DNA甲基化是在甲基化轉移酶的作用下調控基因選擇性轉錄表達的表觀遺傳學修飾。而越來越多的研究表明PAH患者基因組存在DNA甲基化，并且相關基因的甲基化也逐漸被提及。現依據近些年來關于DNA甲基化修飾與PAH患病風險的相關性研究結果作一綜述。

一、 DNA甲基化修飾

在人所有基因組中大約60% ～90%的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）是被甲基修飾的，但CpG島是未被甲基化修飾的[10]。因此DNA甲基化是相對穩定的表觀遺傳學修飾，甚至可以由細胞遺傳。一旦DNA甲基化轉移酶（DNMT）調節出現紊亂時，催化腺苷或胞嘧啶DNA核苷酸通過共價相互作用添加甲基使DNA構象發生改變，阻礙基因轉錄，使得基因表達受到限制。具有特定堿基序列的CpG島序列通常位于基因啟動子中，可以發生較高的甲基化概率，被認為是隱性遺傳的一個標志。DNA甲基化完成轉錄抑制可能通過以下3條途徑完成：①直接屏蔽轉錄因子結合位點；②募集轉錄調節阻遏蛋白；③改變染色質結構，抑制基因表達[11]。近些年來，隨著基因芯片技術及高通量測序技術的發展，對人全基因組甲基化譜的研究逐年增多，涉及多個領域范圍，這些研究大大提高了人類對DNA甲基化在疾病中整體影響的認識。

二、 DNA甲基化及肺血管重塑與PAH的關系

DNA甲基化可以調節某些被甲基化區域的基因表達和血管平滑肌細胞的分化從而促使PAH的形成[12]。PAH的致病基因活化素受體類激酶1（ACVRL1/ALK1）的表達主要集中于血管內皮細胞中，并受CpG島甲基化控制，介導ACVRL1/ALK1啟動子區域的轉錄因子Sp1[13]。持續性血管收縮和血管重塑是PAH的兩個重要的病理變化。有學者證實，具有強烈血管收縮功能的內皮素-1受人肺動脈內皮細胞中胰島素樣生長因子-1（IGF-1）調控，在低氧誘導肺動脈小鼠模型中，IGF-1啟動子區域有一個特定的胞嘧啶甲基化位點是對缺氧作出反應的，因此推測IGF-1基因甲基化可能調控內皮素-1形成從而對小鼠PAH形成發揮作用[14]。不同刺激（如受傷和缺氧）會導致肺動脈壁結構和功能上的改變，隨后引起細胞存活和凋亡之間的不平衡，從而引發了肺血管的重塑，超氧歧化酶2（SOD2）啟動子區域CpG島甲基化引起氧化還原反應信號通路受損，從而造成肺動脈平滑肌細胞（PASMC）的增殖與凋亡抵抗，最終引發PAH[15-16]。肺動脈壓力的增加伴隨著肺血管重塑的不斷增加，DNA甲基化參與調控PAH的肺血管重塑。

三、 相關基因甲基化與PAH的關系

1.編碼SOD2基因

SOD2基因編碼線粒體中的SOD。SOD2是一種由過氧化氫（H2O2）參與監管的酶，與低氧誘導因子-1α（HIF-1α）相互作用，也有腫瘤抑制基因的作用[17]。在SOD2介導的細胞增殖和凋亡中，PASMC受到影響，首先在fawn-hooded大鼠模型和IPAH患者中被證實，而在人PAH中，肺動脈和從狀病變中發現SOD2的缺乏[18]。Archer等[16]證實在自發性PAH的fawn-hooded大鼠模型和人高度增殖的平滑肌細胞中SOD2基因表達下降，導致線粒體低極化，引起氧化還原反應信號通路受損，損害了機體氧化應激信號通路，激活HIF-1α，使得PASMC過度增生，調亡抵抗，從而誘發PAH，且SOD2表達的下降主要是通過SOD2啟動子區域CpG島DNA甲基化引起SOD2基因轉錄抑制所致。調節5-氮雜胞苷（甲基轉移酶抑制劑）逆轉了甲基化和增加了SOD2的表達。隨后fawn-hooded大鼠模型中增加SOD2降低了平均肺動脈壓力和動脈厚度。這些發現清晰地凸顯了通過SOD2和HIF-1α致使PASMC增殖的表觀遺傳通路，并為PAH的治療提供了新的靶點。

2.IGF-1基因表達

Perkett通過對山羊持續性空氣栓塞12 d形成PAH模型，發現IGF-1在第2日時顯著升高，并在12 d中持續升高[19]。IGF-1對肺血管平滑肌細胞有促進其增殖的作用，并促使肺血管重塑，在低氧刺激下，IGF-1信號在肺動脈內皮細胞和平滑肌細胞呈激活狀態，IGF-1參與低氧性肺血管重塑，以內分泌和自分泌/旁分泌方式刺激血管平滑肌細胞增生肥厚[20-21]。IGF-1基因的mRNA表達與DNA甲基化及組蛋白修飾關聯密切，其通過調節肺動脈內皮細胞表達內皮素-1而發揮作用，組蛋白脫乙酰酶（HDACs）調節IGF-1的表達。Zhao等[22]研究證實，HDAC1和HDAC5的水平在2組PAH患者和一組PAH大鼠模型中均高于對照組，并證實組蛋白乙酰化的表觀遺傳學修飾與PAH的發生發展有關系，而HDACs抑制劑可以對上述大鼠模型的PAH發生逆轉。另外，Yang等[14]通過對小鼠的實驗性研究發現，HDACs抑制劑抑制的HDACs將減少新生小鼠肺內低氧誘導的DNA甲基化總體水平和肺內IGF-1啟動子區域周圍的胞嘧啶甲基化水平。但是國內外關于HDACs抑制劑通過影響DNA甲基化從而影響IGF-1基因表達，致使PAH進一步發展的研究并不多，這可能是未來研究的一個新方向。

3.腺苷三磷酸結合盒轉運體A1（ABCA1）

ABCA1是具有跨膜結構域的對稱結構，近幾年，對于ABCA1的研究是國內外的熱點。其在膽固醇逆向轉運、代謝及高密度脂蛋白代謝過程中發揮重要作用，國外學者證實ABCA1 DNA甲基化抑制了ABCA1的表達，造成體內膽固醇大量蓄積[23]。膽固醇在肺血管內積聚造成肺血管增粗，可能會引起PAH，國內有學者證實他汀類藥物對PAH有治療作用，從側面證實了這一點[24]。炎癥作用是PAH的發病機制之一，另外IL-8等炎癥因子可參與血管重構和血管新生，使得PAH進一步進展[25]。在肺內ABCA1蛋白的表達與炎癥反應密切相關，ABCA1介導的膽固醇運輸活動與ABCA1抗炎活性有關[26]。炎癥反應本身就是PAH的一個發病因素。國外學者實驗證明，PAH肺動脈內皮細胞中ABCA1基因啟動子序列與正常人相比呈高甲基化狀態[19]。

4.與PAH有關的其他基因

除了以上3中研究較多的基因外，國內外報道較多的與PAH形成及發展有關的基因包括骨形態發生蛋白2基因、5-羥色胺轉運體基因等，另外，PAH中，小窩蛋白、酸敏感鉀離子通道蛋白3、SMAD9基因的突變已被證實，而這些基因的甲基化或多個基因表達水平協同作用可能都會導致PAH形成。

5.與PAH患病相關的基因

筆者收集了6例PAH和6名正常人作預實驗，其中，病例組1包括4例可逆病人，病例組2包括2例不可逆病人。通過病例組1與對照組的比較，調整P值具有統計學意義的有4個基因。通過病例組2與對照組的比較，調整P值<0.05的有6個基因。2個病例組相比較，我們發現了16個調整P值<0.05的基因。之后，我們在有統計學差異的基因中篩選出位于編碼區或者UTR區（非編碼區）的候選基因，它們分別是：ABCA6（17q24.3），C13orf28（13q34），MMP27（11q24），COPB1（11p15.2），HLA-DRB6（6p21.3），HLA-DRB1（6p21.3），HLA-DRB5（6p21.3）[27]。這有助于說明肺動脈高壓與基因位點的甲基化有著密切關聯。

四、 總結與展望

大量研究結果表明，PAH的發生是遺傳因素與環境因素共同作用的結果，而表觀遺傳學正是從遺傳-環境相互作用的角度來探討疾病的發生。目前越來越多的證據表明表觀遺傳學機制參與PAH的形成及發展，而DNA甲基化是主要的表觀遺傳調控機制之一，其對PAH影響的研究還處于初步階段，在PAH領域中，亟需開展表觀遺傳學方面的研究。哪一些基因甲基化影響PAH，這些相關基因在什么時候發生甲基化，DNMT如何識別基因甲基化位點等等還需要更進一步深入研究。隨著對PAH患者或動物模型的相關基因的差異甲基化和外周血全基因組的甲基化譜的進一步研究，將有助于我們對PAH發生發展的認識，并為PAH的治療提供新的靶點。

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（收稿日期：2017-10-06）

（本文編輯：楊江瑜）