口蹄疫病毒熒光RT—PCR檢測(cè)試劑盒的篩選

凌洪權(quán) 黎朝燕 楊澤林 謝建華 董春霞 黃恒 鐘小艷 吳昌義

摘要：為了及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷口蹄疫疫情，避免誤診而造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，我們對(duì)5個(gè)不同生物技術(shù)有限公司（分別以A、B、C、D、E代替）生產(chǎn)的口蹄疫病毒通用型、O型、A型、Asia1型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了試驗(yàn)對(duì)比，最終從通用型和3個(gè)分型試劑盒的靈敏性、交叉反應(yīng)、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、反應(yīng)速度、操作簡(jiǎn)便性等方面篩選出了B公司的試劑盒相對(duì)優(yōu)于其他4個(gè)公司的試劑盒。

關(guān)鍵詞：口蹄疫；試劑盒；篩選

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.004

口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）屬于微RNA病毒科（Picornaviridae）、口蹄疫病毒屬（Aphthovirus）的單股正鏈RNA病毒，含有7個(gè)型（O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3）和多種亞型[1]。能夠感染多種偶蹄動(dòng)物，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)、政治和社會(huì)問(wèn)題[2-3]。在我國(guó)以及非洲和亞洲的許多國(guó)家流行，其傳播速度快、感染率高，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的發(fā)展以及動(dòng)物產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易[4-5]。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病，也是我國(guó)一旦發(fā)生必須上報(bào)的一類(lèi)動(dòng)物傳染病之首[6]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)5個(gè)生物技術(shù)有限公司提供的口蹄疫病毒試劑盒進(jìn)行比較，旨在為及時(shí)、準(zhǔn)確地處理口蹄疫疫情提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 抗原

口蹄疫病毒A型抗原、O型抗原、Asia1型抗原購(gòu)自國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 試劑

口蹄疫病毒通用型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、口蹄疫病毒O型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、口蹄疫病毒A型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、口蹄疫病毒Asia1型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 A、B、C、D、E 5個(gè)公司。

1.3 核酸提取試劑盒

核酸提取試劑盒（磁珠法）購(gòu)自天隆科技生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

依據(jù)《口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》GB/T 22915-2008。

2 結(jié)果

2.1 口蹄疫病毒通用型熒光RT-PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果表（見(jiàn)表1）

2.2 口蹄疫病毒O型熒光RT-PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果表（見(jiàn)表2）

2.3 口蹄疫病毒A型熒光RT-PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果表（見(jiàn)表3）

2.4 口蹄疫病毒Asia1型熒光RT-PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果表（見(jiàn)表4）

2.5 口蹄疫病毒通用型、O型、A型、Asia1型熒光RT-PCR試劑盒結(jié)果評(píng)比表（見(jiàn)表5）

評(píng)分和靈敏性指標(biāo)：

操作簡(jiǎn)便性：配制反應(yīng)體系時(shí)，幾種同類(lèi)試劑盒比較，最便捷得3分，中等得2分，最差得1分。

反應(yīng)體系一致性：每個(gè)公司4種試劑盒配制體系時(shí)各個(gè)成分的量完全一致得3分，3種一致或2、2一致得2分，只有2種一致得1分，全都不一致得0分。

反應(yīng)條件一致性：通用型與3種分型試劑盒的反應(yīng)條件完全一致得3分，3種一致或2、2一致得2分，只有2種一致得1分，全都不一致得0分。

交叉反應(yīng)：無(wú)交叉反應(yīng)且增長(zhǎng)趨勢(shì)好者得3分、增長(zhǎng)趨勢(shì)一般者得2分、增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩者得1分；有交叉反應(yīng)者得0分。

靈敏性：首先淘汰有交叉反應(yīng)者，再根據(jù)CT值與平均值比較，CT值越小或越接近平均值且增長(zhǎng)趨勢(shì)越好者靈敏性越高。

經(jīng)過(guò)對(duì)5個(gè)公司口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒的比較，篩選出B公司的試劑盒相對(duì)于其他4個(gè)公司的試劑盒操作簡(jiǎn)便、通用型與3個(gè)分型能在同一臺(tái)熒光PCR儀上同時(shí)完成（即反應(yīng)條件一樣）、各個(gè)分型試劑盒無(wú)交叉反應(yīng)、靈敏性較高等優(yōu)勢(shì)，因此B公司的試劑盒是首選。

3 討論

口蹄疫診斷技術(shù)包括口蹄疫病毒的微量補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、食道探杯查毒試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），病毒中和試驗(yàn)、液相阻斷一酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、病毒感染相關(guān)抗原（VIA）瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID）試驗(yàn)（適用于檢測(cè)各種不同樣品中的口蹄疫病毒抗原或抗體）[7]以及口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法（適用于動(dòng)物及其動(dòng)物產(chǎn)品中口蹄疫病毒的檢測(cè)）[8]。確診口蹄疫疫情時(shí)，一般都是檢測(cè)樣品中是否含有口蹄疫病毒，因此RT-PCR或熒光RT-PCR方法較為常用。RT-PCR方法相對(duì)比熒光RT-PCR方法較為復(fù)雜、耗時(shí)也長(zhǎng)，所以熒光RT-PCR方法是確診疫情的首先方法。

由于口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒有諸多的優(yōu)特點(diǎn)，因此市場(chǎng)上熒光檢測(cè)試劑盒猶如春筍般的涌現(xiàn)出來(lái)，生產(chǎn)廠(chǎng)家較多，但是檢測(cè)效果各異。為了準(zhǔn)確地診斷疫病，在選用不同公司的試劑盒之前一定要做試驗(yàn)比較，不能盲目地根據(jù)價(jià)格的高低而輕易選購(gòu)，否則誤診會(huì)造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉慶軍，張永光.口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)及其功能[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005， 26（5）：1-5.

[2] Thomson G R， Vosloo W， Bastos A D S.Foot and mouth disease in wildlife [J].Virus Research，2003，91（1）：145-161.

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[8] 羅長(zhǎng)保，魚(yú)海瓊，林志雄.應(yīng)用熒光RT—PCR技術(shù)檢測(cè)口蹄疫病毒[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志， 2003，39（12）：31.