麻瘋樹雌雄花中MADS—BOX基因的表達分析

廖望 閆曉雪 吳軍 陳放

摘 要： 麻瘋樹（Jatropha curcas）種子含油率高，種子中的油類物質可作為生物柴油被開發和利用，是極具潛力的生物質能源樹種之一。麻瘋樹雌雄異花，在自然條件下雄花數量通常遠遠大于雌花，這大大限制了種子和油的產量，因此開展麻瘋樹性別分化與花發育分子機理的研究具有重要意義。該研究選取10個麻瘋樹的MADS-BOX基因（JcAGL1，JcAGL6，JcAGL9，JcAGL11，JcAGL15，JcAGL61-3，JcAGL62-1，JcAGL62-6，JcAGL62-7，JcAGL80-2），提取麻瘋樹早期發育各個階段的雌雄花總RNA，并反轉錄成cDNA，采用實時熒光定量方法，探索早期發育不同階段的麻瘋樹雌雄花目的基因的表達情況。結果表明：目的基因在發育起始的雌雄花中的表達具有差異，比如JcAGL6和JcAGL15在雄花中表達量要高于雌花，而JcAGL1，JcAGL9和JcAGL11在雌花中的表達量要高于雄花，這說明花原基中目的基因表達會直接或間接決定性別分化的方向；在之后的發育過程中，目的基因的表達情況在雌雄花中有所不同：隨著花的發育，目的基因在雌雄花中的表達量變化存在差別，這反應出麻瘋樹雌雄花發育中目的基因表達模式上的差異；另外，也能看出在此過程中各個目的基因又發揮著不同的功能。該研究結果為進一步探究麻瘋樹雌雄花發育相關基因的表達提供了理論依據，為了解麻瘋樹性別分化和花發育的分子機理奠定了基礎。

關鍵詞： 麻瘋樹， MADS-BOX基因， 性別分化， 花發育， 實時熒光定量PCR

中圖分類號： Q945.4， Q75

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2018）02-0180-08

Expression analysis on MADS-BOX genes in male and female flowers of Jatropha curcas

LIAO Wang， YAN Xiaoxue， WU Jun， CHEN Fang*

（ College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610041， China ）

Abstract： The members of the MADS-BOX transcription factor family play essential roles in sex differentiation and flower development in many plants. Jatropha curcas is a monoecious plant， which has been seen as one of the potential biomass energy tree species because oil content in the seeds is high and it can be used as biodiesel. However， seed oil production is mainly depended on seed yield， which is restricted by the low ratio of female flowers to male flowers. So the number of female flowers is one of the key factors to increase seed yield， and it is of great significance to analyze the causes of the differences in the number of female and male flowers and to study the molecular mechanisms of sex differentiation and flower development in J. curcas. In order to investigate the molecular mechanisms of sex differentiation and flower development， we chose ten members of MADS-BOX family gene in J. curcas （JcAGL1， JcAGL6， JcAGL9， JcAGL11， JcAGL15， JcAGL61-3， JcAGL62-1， JcAGL62-6， JcAGL62-7， JcAGL80-2）， total RNA were extracted from female and male flowers at different stages of early developments， cDNA were synthesized by using these RNA， and qRT-PCR method was used to detect and analyze the expression of these genes in female and male flowers. The results were described as below： The expression of target genes was different between pistillate and staminate at the beginning of development， for example， the expression of JcAGL6 and JcAGL15 in staminate flowers was higher than that in pistillate flowers， while the expression of JcAGL1，JcAGL9 and JcAGL11 in pistillate flowers was higher than that in staminate flowers， showing that the expression of target genes in floral primordia directly or indirectly determines the direction of sex differentiation. Expression level of target genes was different between pistillate and staminate flowers in later development： With flowers development， the variation of target genes expression in pistillate and staminate flowers was different， indicating different expression patterns of target genes between pistillate and staminate flowers. In addition， it can be seen that each target gene has different functions in the process. Our results provide theory evidence to further study the expression of genes related to the development of pistillate and staminate flowers， and lay the foundation for understanding the molecular mechanism of sex differentiation and flower development in J. curcas.

Key words： Jatropha curcas， MADS-BOX genes， sex differentiation， flower development， qRT-PCR

麻瘋樹（Jatropha curcas）為大戟科麻瘋樹屬植物，多年生木本，原產于美洲熱帶地區，在我國也有分布（中國科學院植物研究所，1979）。麻瘋樹種子含油率高，可用于生產生物燃油而得到廣泛關注 （Bahadur et al， 2013）；麻瘋樹種子中還含有蛋白質、多肽、萜類和一些小分子物質，如種仁中含有一類核糖體失活蛋白（curcin），可能具有抗腫瘤作用（Lin et al，2003）；另外，植株中的一些活性成分還可以用于殺蟲和抑菌（Wei et al，2004）。因此，麻瘋樹在生產生物燃油的同時，還可開發出不同種類的醫藥產品，具有較好的發展前景。

麻瘋樹屬雌雄同株異花植物（Negussie et al，2014）為二歧聚傘花序，一個花序上雌雄花的比值為1∶10～1∶20（郭承剛等，2007；何亞平等，2008）。種子的產量是麻瘋樹產業發展的關鍵（Chikara & Jaworsky，2007），而麻瘋樹雄花的數量遠遠多于雌花則極大地限制了種子的產量。因此，分析造成麻瘋樹雌雄花數量差異的原因以及開展麻瘋樹性別分化與花發育分子機理的研究對該產業的發展具有重要意義。

MADS-BOX蛋白家族在植物性別分化和花發育上起著十分重要的作用（Smaczniak et al，2012）。MADS-BOX家族蛋白是一類重要的轉錄因子（Pellegrini et al，1995；Huang et al，2000），該類蛋白的特點是在N端含有一段比較保守的MADS結構域。MADS-BOX蛋白因在結構上的差異分為兩類：Ⅰ型（TypeⅠ）和Ⅱ型（TypeⅡ）。Ⅰ型只含有一段MADS-BOX區域（De Bodt et al，2003；Kofuji et al，2003；Parenicová et al，2003），而Ⅱ型除了N端含有MADS-BOX區域外，通常在其下游還具有I （intervening）和K （keratin-like）區域，此外在其C端還含有一段高度可變的區域，這四個區域統稱為MIKC結構（Kaufmann et al，2005），所以Ⅱ型又被稱為MIKC型（MIKC-type）。Ⅰ型往下又可分為Mα、Mβ、和Mγ三個亞族；Ⅱ型又可分為MIKCC型和MIKC*型兩種（Henschel et al，2002）。目前，對于Ⅰ型的研究比較少，只在擬南芥中有部分報道（Khler et al，2003，2005；Portereiko et al，2006；Yoo et al，2006；Bemer et al，2008；Colombo et al，2008；Kang et al，2008；Steffen et al，2008），其具體功能并不是十分清楚。Ⅱ型MADS-BOX蛋白研究得比較多，具體功能在許多植物中也得到證實，Ⅱ型MADS-BOX蛋白與植物性別分化以及花發育有關并且也參與植物其他的生理生化反應（黃方等，2012）。在花發育ABCDE模型中，參與花發育的基因分為ABCDE五類，除A類中AP2之外，其余證實均為MADS-BOX家族蛋白（Wollmann et al，2010），可見其在花發育中所起的重要作用。

本研究通過RT-PCR技術對麻瘋樹的10個MADS-BOX基因在雌雄花早期發育的不同階段的表達情況進行分析，初步探究這些基因與麻瘋樹雌雄花發育的關系，為深入了解麻瘋樹的性別分化與花發育的分子機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料來源于四川省西昌市金河鄉（26°56′ N，101°68′ E）自然生長的麻瘋樹，于5—7月期間采集麻瘋樹的花序。為保證結果的可靠性，每株麻瘋樹只采集1個花序，共采集20個；根據Wu et al（2011）對麻瘋樹雌雄花發育階段的描述，將花發育過程分成三個階段（第一階段、第二階段、第三階段），通過體式顯微鏡（Olympus，SZ2）觀察，在花序上篩選到第一、第二、第三階段的雌雄花（圖1），所取材料立即放入液氮，帶回實驗室于-80 ℃保存待用。

1.2 方法

選取10個基因進行表達分析，分別為AGAMOUS-like 1（JcAGL1，Gene ID：105629543），AGAMOUS-like 6（JcAGL6，Gene ID：105643077），AGAMOUS-like 9（JcAGL9，Gene ID：105644835），AGAMOUS-like 11（JcAGL11，Gene ID：105635126），AGAMOUS-like 15（JcAGL15，Gene ID：105628766），AGAMOUS-like 61-3（JcAGL61-3，Gene ID：105634538），AGAMOUS-like 62-1（JcAGL62-1，Gene ID：105631663），AGAMOUS-like 62-6（JcAGL62-6，Gene ID：105639905），AGAMOUS-like 62-7（JcAGL62-7，Gene ID：105644754），AGAMOUS-like 80-2（JcAGL80-2，Gene ID：105636743）。通過NCBI數據庫獲得這10個基因所編碼蛋白的氨基酸序列，利用DNAman6.0軟件對這10個蛋白質進行氨基酸序列對比，NCBI數據庫（http：//www.ncbi.hlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進一步分析蛋白質所具有的蛋白質保守結構域，確認這10個基因均為MADS-BOX家族基因。

1.2.1 總RNA提取和cDNA的獲得 使用TaKaRa MiniBEST植物RNA提取試劑盒（TaKaRa，大連）分別提取三個發育階段麻瘋樹雌雄花的總RNA。用1%瓊脂糖凝膠做電泳檢測RNA完整性，接著用Nanovue分光光度計（Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典）檢測260/280nm和260/230nm下的吸光值以預估RNA的純度，只有OD260/280為1.9～2.1，OD260/230大于2.0的樣品才能用于后續試驗。

使用PrimeScriptTM RT reagents Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，大連）對所提取的RNA進行反轉錄：按照試劑盒說明書，先對樣品進行去基因組DNA反應，之后再進行反轉錄反應獲得cDNA并于-20 ℃保存待用。

1.2.2 目的片段的普通PCR擴增 根據Karuppaiya et al（2017）對麻瘋樹內參基因的篩選，選取EF（Elongation factor 1-alpha）作為本實驗的內參基因，按照定量PCR引物設計原則，利用Primer Premier 6軟件設計這11個基因的定量PCR引物（表1），所有引物均由華大基因合成。

隨機選擇某一時期的雌雄花的cDNA作為模板用以上引物進行普通PCR反應，反應體系20 μL，其中2×TSINGKE Master Mix（blue） （TSINGKE，北京）10 μL，模板、正向引物、反向引物各1 μL，ddH2O 7 μL；普通PCR反應程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共35個循環；72 ℃ 10 min；12 ℃保存。PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 目的基因的定量檢測 采用CFX Connect system（Bio-Rad）對三個時期雌雄花的目的基因進行RT-PCR檢測，反應體系25 μL，其中的組分為2×SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus） 12.5 μL，正向引物（10 μmol·L-1） 1 μL，反向引物（10 μmol·L-1） 1 μL，cDNA 1 μL，RNase Free ddH2O 9.5 μL。以無模板體系作為對照組，每個樣品3個重復，按如下反應程序進行RT-PCR反應：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，每個循環結束后均會對熒光信號進行采集，共40個循環；65 ℃開始，以每步0.5 ℃的速度升高至95 ℃，每個溫度維持5 s時間采集信號，取溶解曲線為單峰的數據，通過2-ΔΔCT（Livak）法對數據進行處理，得到相對表達結果，用GraphPad Prism 5軟件繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1目的片段的擴增

對提取的總RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳和質量檢測，圖2結果顯示OD260/280均在1.9～2.1之間且OD260/230>2.0，說明RNA質量符合后續實驗要求。以設計的目的基因以及內參基因EF引物對cDNA進行普通PCR擴增，經測序和1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示均得到預期的目的片段。

2.2 麻瘋樹雌雄花早期不同階段目的基因的定量分析

qPCR結果如圖3所示，JcAGL1和JcAGL9基因在雌雄花中表達狀況相似，在雌花早期發育的第一階段有相對比較高的表達，隨后花發育時期進入第二階段直至第三階段表達量逐漸下降；但兩個基因在雄花發育初期表達量相對較低，且隨著花的發育，表達量逐漸上升。JcAGL6無論是在雌花還是雄花中，隨著花發育均呈現逐漸下降的趨勢，但整體上雄花中的表達量要高于雌花。JcAGL11在雌雄花中的表達情況明顯不同，雖然雌花發育的第二、第三階段相對于第一階段有所下降，但三個階段均處于比較高的表達水平；雄花中雖然第二階段相對于其他兩個階段的表達量有所上升，但整體上都處于較低表達的狀態。JcAGL15基因在雄花發育的三個階段一直有比較高的表達，且表達量基本穩定；在雌花發育中，一階段未表達或表達量過低，到二階段才有明顯的表達，直至第三階段達到較高的水平。JcAGL61-3在雌花中的表達如同JcAGL1和JcAGL9，初期表達量很高，遠高于JcAGL1和JcAGL9在雌花發育第一階段的表達量，之后隨時間表達量逐漸降低，但依舊有較高的表達水平；在雄花中，第一階段的表達量相較于雌花低，到第二階段有所上升但仍低于雌花，到第三階段又下降。JcAGL62-1在雌花中的表達隨發育先下降后上升，第一階段表達量很高，第三階段相較第二階段雖有所上升但不及第一階段水平；在雄花中表達量則是先上升后下降。JcAGL62-6在雌花中的表達量基本保持穩定的，而在雄花中表達量則是逐漸上升。JcAGL62-7在雄花中表達量逐漸上升；在雌花中，表達量隨時間先上升后降低，在第二階段的表達量最高。JcAGL80-2在雌花中表達量先下降后上升，第三階段和第一階段表達水平相似；在雄花中表達量逐漸上升，但第二階段到第三階段上升幅度不大（如圖3）。

3 討論與結論

根據Wu et al（2011）對麻瘋樹早期花發育的描述，通過體式顯微鏡對麻瘋樹雌雄花進行形態結構觀察，將采集到的處于發育早期的麻瘋樹雌雄花按發育時期分成第一、第二、第三階段。第一階段為花發育的起始，開始由營養生長向生殖生長轉變，花原基出現并開始發育。大量研究表明，雌雄分化是花原基選擇性發育的結果（Delong et al，1993； Grant et al，1994），在分子水平上就是表現為相關基因的選擇性表達，因此麻瘋樹花早期發育的第一階段特定基因的差異表達是決定麻瘋樹花性別的重要因素。從表達結果可以看出，在第一階段各個目的基因在雌雄花中的表達情況均有一定的差異，其中JcAGL1， JcAGL9， JcAGL11， JcAGL15， JcAGL61-3，

JcAGL62-1差異最為明顯，表明目的基因的差異表達可能會影響雌、雄花原基的分化。

在發育初期決定花原基性別后，各個目的基因表達水平的變化又直接或間接影響雌雄花的進一步生長發育。JcAGL1和JcAGL9在雌雄花中的表達模式相反，在雌花中隨著發育表達量逐漸降低，說明對雌花發育有負調控作用；在雄花中則是逐漸升高，說明還能正向調控雄花發育。JcAGL11在花發育三個階段雌花中的表達量均明顯高于雄花，這表明該基因在雌花的早期發育過程中發揮重要作用。JcAGL15在第一、第二階段雄花中表達量要明顯高于雌花，該基因在發育初期的高表達有效促進花原基向雄花分化；第三階段該基因在雌花中表達量明顯上升，雌雄花中表達水平接近，說明JcAGL15也可以促進雌雄蕊的進一步成熟，在擬南芥中AtAGL15主要參與胚胎發生和果實成熟（Heck et al，1995；Fernandez et al，2000；Harding et al，2003），JcAGL15在第三階段的表達情況可能是在為胚胎的發生做準備，這與擬南芥中功能相似。JcAGL61-3和JcAGL62-1在第一階段發育中雌花的表達量要明顯高于雄花，高表達可以誘導花原基向雌花發育；之后JcAGL61-3在雌花中的表達量逐漸降低，呈現出負調控作用；而JcAGL62-1在雌花中表達量迅速下降至與雄花相當的表達水平，可能是因為該基因主要是在發育起始這一特定時期發揮功能，行使功能后便迅速恢復至正常水平。JcAGL62-6在雄花中表達量逐漸升高，說明有促進雄蕊發育的作用；在雌花中沒有明顯變化，說明不參與雌蕊的發育；而且無論是在雌花還是雄花中表達量都比較高，說明可能還有參與到花非性別器官的生長和發育。JcAGL62-7和JcAGL80-2在雄花中表達量逐漸升高，表現出正調控作用；在雌花的第二個發育階段JcAGL62-7表達相對于其他兩個階段上調，而JcAGL80-2則是下調，說明這兩個基因在雌花第二階段的發育中發揮較大的作用，前者為正調控，后者為負調控。JcAGL6在雌雄花中表達差異不大，表達量隨著發育逐漸降低，說明可能主要參與到花的發育，對性別分化的影響較小。

本研究利用qRT-PCR對麻瘋樹中的10個MADS-BOX基因的表達進行了檢測和分析，結果表明目的基因參與麻瘋樹的雌雄分化以及花發育，而且各個基因表達情況不同，說明它們各自發揮不同的功能，但所發揮的具體功能以及相關機理尚不是很清楚，因此還需要進一步對目的基因的功能進行探究。

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