油棕種殼厚度控制基因SHELL的SNP分子標記開發

石鵬 夏薇 肖勇 王永 曹紅星 李東霞 雷新濤

摘 要： 油棕屬棕櫚科多年生木本油料作物，果實含油量高達50%，且單位面積產油量高，享有“世界油王”美譽。油棕果實由外果皮、中果皮、內果皮（種殼）、種子四個部分組成，產油部分主要是中果皮和種子，其中種殼厚度是影響果實含油量的重要因素。SHELL基因控制種殼厚度，是一類MADS-box同源基因，SHELL基因在厚殼種和無殼種中的變異主要是第一個外顯子上的兩個SNP位點。該研究根據兩個SNP位點進行特異標記開發，根據已知的油棕SHELL基因的序列，設計了4對SNP引物。4對SNP引物以2個SNP位點設計，每個SNP位點設計2對SNP標記，并均在引物3′端第二位引入強錯配堿基。以2份薄殼種油棕材料和2份厚殼種油棕材料DNA為模板，擴增篩選油棕SHELL基因SNP引物。通過PCR擴增發現，設計的SHELL基因特異SNP標記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r能夠鑒別油棕厚殼種和薄殼種。再用24株油棕樹進行特異性驗證，發現該標記能較準確地判斷油棕的厚薄殼。該研究結果表明SNP標記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可用來進行油棕種質資源早期分子鑒定，為高產油棕品種選育提供了技術支撐。

關鍵詞： 油棕， 種殼厚度， SHELL基因， 錯配堿基， SNP標記

中圖分類號： Q949.9， S59

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2018）02-0195-07

SNP markers development of SHELL controlling shell thickness in oil palm （Elaesis guineensis）

SHI Peng1， 2， XIA Wei3， XIAO Yong1， 2， WANG Yong1， 2， CAO Hongxing1， 2， LI Dongxia1， 2， LEI Xintao1， 2*

（ 1. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang 571339， Hainan， China； 2. Hainan Key Biological Laboratory of Tropical Oil Crops， Wenchang 571339， Hainan， China； 3. Hainan University， Haikou 570228， China ）

Abstract： Oil palm （Elaeis guineensis ） belongs to palmae perennial woody oil crop， known as “oil king of the world”， and its fruit oil content is up to 50%. Fruit of oil palm consists of exocarp， mesocarp， endocarp （shell） and seed， mesocap and seed is the resource of oil， and shell thicknees play an important role in fruit oil content. SHELL gene controls the shell thickness， which is a kind of MADS-box homologous gene. Moreover， variation of SHELL between dura and pisifera is mainly two SNP loci in the first exon. Specific markers were developed according to two SNP loci， in order to evaluate germplasm resources of oil palm early. Four SNP markers were designed according to SHELL gene sequence. Four pairs of SNP primers were designed with two SNP loci， which existed strong mismatch base in the second position from 3′-end respectively. Four pairs of SNP primers were amplified in two tenera palms and two dura palms to screen effective primers. PCR result showed that SNP marker EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r was able to identify dura and tenera palms effectively. Verification experiment using 24 plants revealed that this marker could accurately determine the shell thickness of oil palm. In this study， results showed that SNP marker EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r might be used for early molecular identification， which would provide technical support for high yield breeding of oil palm.

Key words： oil palm， shell thickness， SHELL gene， mismatch bases， SNP markers

油棕（Elaeis guineensis）是棕櫚科油料作物，其生產的棕櫚油和棕櫚仁油應用廣泛（Cornelius，1977；李瑞等，2009）。近年來，受益于全球食用油需求的迅猛增長和油棕種植面積的快速擴張，棕櫚油和棕櫚仁油產量達到4 500萬t，占世界食用植物油產量的32%（Murphy，2009）。在2006年，就超越大豆，成為全球最重要的油料作物。然而，隨著油棕種植面積的快速擴大，造成熱帶雨林生物多樣性降低等生態危機也越來越嚴重（Wilcove & Koh，2010；Foster et al，2011；Koh & Wilcove，2008；Koh et al，2011）。在全球食用植物油需求繼續增加，油棕種植面積不能繼續擴大的前提下，提高油棕單位面積產油量是實現這些目標的唯一途徑。油棕產油部分主要是果實，所以果實的含油量是影響單位面積含油量的重要因素。

在非洲油棕進化和育種過程中一個關鍵的事件就是包裹種仁的厚種殼消失。現在的非洲油棕有三種果實類型，厚殼型（dura），無殼型（pisifera）和薄殼型（tenera），其中薄殼種是厚殼種和無殼種的雜交種（Corley & Tinker，2007）。薄殼種油棕產油量高于厚殼種，是東南亞地區商業棕櫚油生產的主要來源。Singh et al（2013a）通過測序進行同源定位，確定了控制油棕種殼厚度的基因是擬南芥中控制子房形成和種子發育的MADS-box基因STK的同源基因SHELL。這個基因控制著油棕最重要的經濟性狀，用其選育的薄殼種油棕也對全球食用油生產，生物能源和熱帶雨林保護產生有利影響。

油棕果實由四部分組成：外果皮、中果皮、內果皮（種殼）和種仁。內果皮發育成熟后形成類似椰子殼的纖維環，薄殼種油棕正是因為其種殼薄而獲得更高的產油量。控制這種性狀的SHELL基因是共顯性單基因遺傳。利用厚殼種與無殼種培育優良的薄殼雜交種顯然是進行油棕常規育種的重要途徑，然而僅僅依靠人工去鑒別育種親本的類型顯得費時費力，延長了育種周期，而且還不準確（Mathews et al，2008）。因此利用分子標記輔助育種成為了培育高產薄殼油棕的新途徑。

單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphisms， SNP）是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP大多是雙等位基因，共顯性遺傳（Krawczak， 1999；Xing et al， 2005）。目前它已經作為新一代分子標記，在分子遺傳學研究中發揮著重要作用（Liu et al，2012）。在植物分子生物學研究中，SNP標記已經受到各國學者的高度重視，目前在水稻、番茄、土豆、玉米、油菜和棉花等糧食和經濟作物中開展了SNP研究（楊廣闊等，2014；Hayashi et al，2004；姚祝平等，2015；Sattarzadeh et al，2006；樂素菊等，2012；孫妍妍等，2015；匡猛等，2016）。基于普通PCR技術的SNP標記開發具有低成本和便捷的優勢，利用SNP標記對油棕進行輔助育種培育薄殼雜交種油棕開辟了一條新途徑。本研究以2份薄殼種油棕和2份厚殼種油棕為實驗材料，以SHELL基因為模板開發了4對SNP標記，為油棕種殼厚度基因SHELL的分子標記輔助育種奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料取自中國熱帶農業科學院椰子研究所椰子大觀園，薄殼種油棕材料編號：B1、B2；厚殼種油棕材料編號：H4、H5。來自海口三江油棕基地的24株油棕單株為隨機選取，編號為1-24。

1.2 方法

1.2.1 油棕種殼類型鑒定 取油棕單株上所結成熟油棕果實，用園藝專用剪刀剪開果實，用游標卡尺測量種殼厚薄，小于1 mm并且大于0 mm的認定為薄殼種，大于3 mm認定為厚殼種。

1.2.2 DNA的提取 取實驗材料各單株油棕葉片1～2片，將其裝入取樣袋中，寫明編號，用液氮速凍后備用。采用CTAB小樣提取法（周麗霞等，2013）對油棕材料進行DNA提取。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA是否降解，用Nano Drop 2000測定DNA的濃度，其后將所有材料的DNA用滅菌ddH2O稀釋到50 ng·μL-1備用。

1.2.3 引物設計 利用Primer primer 5和在線引物設計軟件Primer 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3/），以SHELL基因序列設計了4對SNP引物，本實驗針對86 bp處的T-C轉換和93 bp處的A-T顛換設計引物（表1）。其中，EgSh（L）-f和EgSh（P）-f為T-C轉換處的正向引物；EgSh（K）-f和EgSh（N）-f為A-T顛換處的正向引物，EgSh（SNP）-2r為這4個引物的通用反向引物。

1.2.4 PCR擴增和電泳檢測 PCR反應體系（20 μL）：5 μL模板DNA，2 μL 10×Taq Buffer，1.6 μL Mg2+，0.4 μL dNTP，0.3 μL Taq DNA聚合酶，8.7 μL ddH2O，1 μL正向引物，1 μL反向引物。PCR程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統下檢測拍照。

2 結果與分析

2.1 油棕種殼類型及SHELL基因變異

油棕種殼共有3種類型，厚殼、薄殼和無殼，本研究中利用收集到的厚殼種與薄殼種油棕種質資源來設計和鑒定引物。SHELL基因已經測序（Singh et al， 2013a），分析表明在SHELL基因第一個外顯子86 bp和93 bp處各有一個SNP位點。其中86 bp處為C/T堿基轉換，93 bp處為A/T堿基顛換（圖1）。

2.2 等位基因PCR引物設計與篩選

為了提高引物特異性，該實驗中分別在4條正向引物3′端的第二個堿基位置引入強錯配堿基，并檢測它們的擴增情況。實驗中以B1、B2、H4和H5為材料進行引物篩選，通過篩選來確定這4對引物是否為等位基因的特異引物。引物EgSh（L）-f和EgSh（P）-f為針對86 bp處SNP位點設計的正向引物，EgSh（L）-f為與厚殼基因型相匹配的正向引物，EgSh（P）-f為與薄殼基因型相匹配的正向引物，同時在EgSh（L）-f和EgSh（P）-f的3′端第二位均引入C/T堿基錯配；引物EgSh（K）-f和EgSh（N）-f為針對93 bp處SNP位點設計的正向引物， EgSh （K）-f為與厚殼基因型相匹配的正向引物，

EgSh（N）-f為與薄殼基因型相匹配的正向引物，同時在EgSh（K）-f和EgSh（N）-f的3′端第二位也均引入A/G強錯配堿基。

四對引物分別在兩個薄殼種油棕B1和B2，兩個厚殼種油棕H4和H5中進行PCR擴增，在瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。結果顯示，標記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r在薄殼種中條帶亮，而在厚殼種中沒有檢測到PCR產物，說明該標記能夠區分開厚殼種和薄殼種（圖2）。而其它三對標記均不能區分薄殼種和厚殼種，所以只有標記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可以用于進一步驗證。

2.3 SNP標記驗證

取海口三江油棕基地24株油棕單株的葉片，同時對這些單株上的成熟果實進行種殼厚度測量并記錄。之后提取葉片DNA，用特異引物EgSh（N）-f和EgSh（SNP）-2r做PCR擴增。在瓊脂糖凝膠上電泳，結果顯示所有已知為薄殼種油棕的單株，能夠擴增出亮或較亮的目標條帶，而已知為厚殼種油棕的單株則無亮條帶或較弱（圖3）。結果表明，EgSh（N）-f和EgSh（SNP）-2r標記基本可以用于油棕種殼類型前期分子鑒定。

3 討論與結論

根據公布的SHELL基因序列和SNP變異位點，增加引物3′端第二位錯配堿基，設計了4對SNP標記。在已知種殼厚薄的4份油棕葉片DNA中進行篩選，初步發現標記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可以區分厚殼種和薄殼種。隨后用該標記在24份油棕種質資源中擴增，發現該標記鑒定結果與實際種殼厚薄情況基本一致，標記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可以用于油棕種殼厚薄早期分子鑒定。

油棕種殼厚度與果實含油量關系密切，受母本基因型控制。在油棕雜交育種過程中，如果能對雜交后代進行早期鑒定，將會極大減少優良子代篩選的工作量和時間。早期有人尋找與油棕種殼厚度連鎖的SSR等分子標記，但是準確度有限。隨著油棕基因組測序完成，控制種殼厚度的SHELL基因序列被公布，使得開發更精確的SNP標記成為可能。本研究結合前人研究成果，在引物3′端引入強錯配堿基的方法，獲得較好的特異性擴增結果。理論上，引物3′末端堿基與模板互補才會在適合的條件下發生延伸，但是在實際PCR擴增過程中，3′末端單個堿基的錯配不能阻止擴增延伸，因此在特異引物3′端第二位引入錯配堿基就可以提高引物的特異性（Ye et al，2001；張育垚等，2012；黃代新等，2005）。強堿基錯配類型為C/T和G/A；中等堿基錯配類型為A/A、C/C、G/G、T/T；弱堿基錯配類型為C/A和G/T。因此，該實驗中為了獲得較好的特異擴增效果，在引物3′端第二位上引入了C/T和A/G強錯配堿基。

驗證實驗結果也顯示，該標記能夠初步用于油棕厚殼種和薄殼種的分子鑒定。目前，分子標記輔助選擇已經在包括橡膠和木薯等熱帶作物得到應用，相比之下，油棕分子標記輔助選擇技術的應用還比較滯后（鄭燕梅等，2013；周龍華和蔣立希，2016）。多態性豐富，遺傳穩定性高的SNP標記作為第三代分子標記，便于應用普通PCR技術進行檢測，在油棕等木本作物中應用前景廣闊。國外很早就有油棕種殼厚度控制基因SHELL的相關研究報道，但直到2013年，隨著油棕全基因組序列測序完成，SHELL基因的全部序列才得以公布，為本研究中SNP標記開發奠定了基礎（Singh et al，2013b）。本研究利用最新公布的SHELL基因序列設計分子標記，所開發的SNP標記具有一定的穩定性和可靠性，這將為油棕種殼厚度控制基因SHELL的分子標記輔助育種提供有效的工具。下一步將收集無殼種油棕資源，設計能同時鑒定無殼種、厚殼種和薄殼種油棕的SNP分子標記。

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