銀杏bHLH91轉錄因子基因的克隆及表達分析

何昌文 朱麗 沈珊 張威威

摘 要： bHLH轉錄因子在植物的生長發育、脅迫應答和次生代謝中具有重要的調控作用。該研究通過PCR技術從銀杏（Ginkgo biloba）葉中分離得到了一個bHLH基因的cDNA序列，并將其命名為GbbHLH91。序列分析結果顯示擴增的GbbHLH91基因cDNA序列長度為1 425 bp，開放閱讀框是1 065 bp，編碼354個氨基酸，分子量為 40.1 kDa，等電點為8.20。系統進化分析結果顯示，從用于進化樹構建的bHLH蛋白質聚類情況來看，銀杏GbbHLH91蛋白與裸子植物油松（Pinus tabuliformis）bHLH蛋白親緣關系最近，且與被子植物無油樟（Amborella trichopoda）bHLH蛋白相似性達到60%，表明該基因在進化過程中相對比較保守。實時熒光定量PCR分析發現銀杏bHLH91基因在銀杏的各個組織中均有表達，其中在銀杏葉中表達量最高，在根和莖中基因的表達量次之，在銀杏雌花和果中表達量較少，在雄花中的表達水平最低；GbbHLH91基因在不同發育時期的銀杏葉片中，表達量也存在一定的差異，其中在4月中旬該基因的表達水平達到最高，而后隨著葉片的生長發育，該基因的表達水平呈現下降趨勢。該研究結果為進一步驗證GbbHLH91基因的功能奠定了前期基礎。

關鍵詞： 銀杏， bHLH， 轉錄因子， 基因克隆， 表達分析

中圖分類號： Q943.2

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2018）02-0202-08

Cloning and expression analysis of a bHLH91 transcription factor gene from Ginkgo biloba

HE Changwen1， ZHU Li2， SHEN Shan2， ZHANG Weiwei2*

（ 1. Jingzhou Branch， Hubei Academy of Forestry Sciences， Jingzhou 434020， Hubei， China； 2. College of Horticulture and Gardening， Yangtze University， Jingzhou 435025， Hubei， China ）

Abstract： bHLH transcription factor plays an important role in plant growth， stress response and secondary metabolism. In order to study the function of bHLH transcription factor gene in Ginkgo biloba， we isolated a bHLH gene from G. biloba and carried out bioinformatics and expression analyses. In this study， a cDNA sequence of bHLH gene was isolated from G. biloba by PCR， which was designated as GbbHLH91. DNA sequencing and sequence analysis showed that the amplified GbbHLH91 gene was 1 425 bp， GbbHLH91 gene contained a complete open reading frame， and the open reading frame of GbbHLH91 was 1 065 bp， encoding 354 amino acids. The predicted GbbHLH91 protein had a molecular mass of 40.1 kDa with isoelectric point value of 8.20. Homology analysis with BLASTP and Align X indicated that the putative GbbHLH91 share a high identical with other known bHLH proteins from different plant species. Phylogenetic analysis showed that the GbbHLH91 protein was closely related to bHLH protein from Pinus tabuliformis， and was 60% identity to bHLH from Amborella trichopoda， which indicated the bHLH gene was relatively conserved during evolution. Real-time PCR assay found that GbbHLH91 gene was expressed in all tested tissues of Ginkgo biloba， while expression level in leaf was the highest， followed by root and stem， the GbbHLH91 gene was lowly expressed in female flowers and fruits of G. biloba， and the lowest in male flower. The expression level of GbbHLH91 gene in G. biloba leaves at different developmental stages was also different. The expression level of GbbHLH91 gene was the highest in mid-April， and then the expression level of the gene showed a decreasing trend with the growth and development of G. biloba leaves. These results provide a preliminary basis for further validation of the GbbHLH91 gene function.

Key words： Ginkgo biloba， bHLH， transcription factors， gene clone， express analysis

銀杏（Ginkgo biloba）是一種十分古老的珍貴樹種，享有植物界 “活化石”的美譽，銀杏用途廣泛，具有重要的觀賞、經濟和藥用等價值。銀杏葉活性成分主要是類黃酮和萜內酯。類黃酮作為植物次生代謝主要成分之一，在植物體內具有保護植物免受紫外線損傷（Harborne & Williams， 2000）、調節植物的花色或果實顏色（Lepiniec et al， 2006）、調節生長素運輸和防御病原體和昆蟲（Dixon et al， 2005），以及響應外界脅迫等功能（Cominelli et al， 2005）。銀杏類黃酮是預防治療早期阿爾茨海默病，心血管疾病和癌癥等疾病的有效藥用成分（Diamond et al， 2000）。銀杏也是一種童期特別長的中生代孑遺裸子植物，一般實生苗種植15～20 a才能開花結果，這給銀杏優良品種的選育帶來了嚴重的影響。

bHLH（basic Helix-Loop-Helix）轉錄因子構成了真核生物蛋白質中的一個大家族，其成員在生物的生長發育調控過程中起著極為重要的作用（王勇等，2008）。bHLH蛋白在動物中有6大類 （A-F），其中A類含有20個家族，B-F分別含有12、7、1、3、1個家族（Ledent & Vervoort， 2001）；植物中的bHLH蛋白大多屬于B組，系統發育分析擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、白楊（Populus tomentosa）、苔蘚（Bryophyta）及藻類（Algae）的bHLH轉錄因子，可以將這些植物的bHLH基因細分為32個亞家族（Carreteropaulet et al， 2010）。bHLH轉錄因子在不同的植物組織中廣泛存在，可參與植物的生長發育、脅迫應答以及植物的次生代謝等。例如，在擬南芥中，編碼bHLH蛋白質的雄性不育基因DYT1能夠在絨氈層中高水平表達，控制絨氈層的分化和發育（Zhang et al， 2006）；在許多植物中，bHLH轉錄因子也可以上調次生代謝途徑中酶基因的表達，調控植物中類黃酮、生物堿、萜類等活性成分生物合成（張鑫等，2014）。bHLH參與調控類黃酮代謝往往和其他轉錄因子如MYB，WDR等形成復合物來實現（Nakatsuka et al， 2008）。bHLH轉錄因子在植物體內也可以響應外界生物脅，將葡萄VvbHLH1轉入擬南芥中表達，能夠促進類黃酮的積累和ABA信號傳遞，從而提高擬南芥對鹽和干旱的抵抗力（Wang et al， 2016）。bHLH轉錄因子是蛋白質的一個超級大家族，其在不同植物體內的分子機制尚未研究清楚。

目前，有關bHLH轉錄因子的功能研究在銀杏上尚未見報道。本研究以銀杏為試材，首次通過PCR技術從銀杏葉中分離出目的基因GbbHLH91，分析了該轉錄因子結構特點，以及GbbHLH91基因在銀杏各組織、銀杏葉不同發育時期中的表達水平，為后期驗證生物學功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

用于試驗的30年生銀杏種植于長江大學西校區校園，水肥管理條件相同，長勢一致。隨機選取1株銀杏樹進行樣品采集，在4月中旬，采集用于不同部位分析的根、莖、葉、雄花、雌花，在5月中旬，采集果實；在4月初到7月中旬采集用于不同時間表達分析的銀杏葉片，每兩周采集一次。樣品采集過程中帶一次性手套和口罩。采集后立即在液氮中速凍，帶回實驗室并保存在-80 ℃冰箱中用于后續RNA的提取實驗。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 將采集的銀杏各組織樣品在液氮中碾成粉末狀，參照Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa， MiniBEST）試劑盒說明書提取各組織總RNA。通過使用分光光度計在OD260/280吸光值和1%（w/v）瓊脂凝膠電泳，檢測總RNA的質量、濃度和純度。

1.2.2 GbbHLH91基因cDNA合成與克隆測序 采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，大連）試劑盒把提取的銀杏RNA反轉錄得到cDNA。根據課題組前期測序得到的銀杏轉錄組數據，設計bHLH基因特異引物，送往上海生工合成。上游引物GbbHLHF為5′-GCAGCAGCAGCAACAACAACAACAT-3′，下游引物GbbHLHR為5′-TATTGCTCTAAAAAACCTTTAAGGGACG-3′。以cDNA為模板擴增銀杏bHLH基因。PCR反應體系50 μL：包括ddH2O 40.5 μL，10×Buffer（Mg2+）5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，Taq DNA polymerase（5 U·μL-1）0.5 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃、30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃結束。PCR擴增產物經1%凝膠電泳檢測，利用凝膠回收試劑盒切膠回收預期目的基因產物，純化后連接到pMD18-T（TaKaRa，大連）載體上，并轉化到DH5α大腸桿菌感受態細胞中，轉化后的菌液均勻涂抹在平板上進行藍白斑篩選，挑選白色菌落做菌液PCR，將檢測含有目的基因的菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用在線生物信息學工具blastx和blastp（NCBI， http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），對PCR擴增的核苷酸序列和氨基酸序列進行了比對。使用Vector NTI Suite v11.5和DNAMAN 8來分析GbbHLH91基因的cDNA序列，進行ORF的查找和蛋白質的翻譯。利用在線工具ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）對GbbHLH91氨基酸的分子量、等電點等理化學性質進行分析。利用軟件Align X（Vector NTI Suite V 11.5）對多種植物的bHLH蛋白質進行多重比對分析；在用Clustal X 2.0軟件進行多重序列比對的基礎上，借助MEGA 6.0軟件采用鄰接法（Neighbor-joining）構建系統進化樹，使用Bootstrap對系統樹可信性進行檢驗，重復1 000次。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 使用Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa， MiniBEST）試劑盒分別提取銀杏根、莖、葉、雄花、雌花、果的總RNA，以及不同發育時期葉片的總RNA。按照試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser說明書把提取的RNA反轉錄成cDNA。根據GbbHLH91的cDNA序列設計實時熒光定量引物，上游引物GbbHLHRTS為5′-CGTGAAGGTGCCTTGGCTGAT-3′，下游引物GbbHLHRTA為5′-TGCGACGTTTCCTTTGAATGAGT-3′。qRT-PCR內參基因選用的是GAPDH，其上游引物序列GAPDH-F：5′-CTGGCGTAGAGTATGTGGTTGAAT-3′，下游引物序列GAPDH-R：5′-CACGCCAACAACGAACATG-3′。實時熒光定量PCR在Bio-Rad公司的PCR儀Mini OpticonTM Real-Time PCR system上進行，用SYBR Green熒光染料法進行實時定量表達分析，具體操作步驟參照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TliRNase H Plus）試劑盒說明書。每種實驗樣品進行定量PCR擴增時均進行三次技術重復，bHLH91和內參基因GAPDH以三次重復的cDNA為模板進行定量PCR擴增，并分別設置一個陰性對照（模板為ddH2O）。反應程序為95 ℃、30 s，95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，共40個循環。用Microsoft Excel 2013分析輸出結果，采用2-△△Ct法計算GbbHLH91基因相對表達水平。

2 結果與分析

2.1 GbbHLH91基因全長cDNA克隆和序列分析

利用試劑盒提取銀杏葉總RNA，其OD260/280吸光值在1.8～2.1之間，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示質量較好（圖 1），可用于反轉錄實驗。利用GbbHLH基因特異性引物，從反轉錄獲得的銀杏cDNA中PCR擴增得到一條GbbHLH基因序列。經NCBI網站的Blastx在線程序比對分析顯示該cDNA序列與無油樟的bHLH91序列具有60%相似性；在轉錄因子數據庫中PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/） 運行Blast工具比對擬南芥轉錄因子數據庫，比對結果為擬南芥bHLH轉錄因子家族的bHLH91。兩次比對結果表明從銀杏中克隆的bHLH基因應為bHLH91基因，因此命名為GbbHLH91。該序列長度為1 425 bp，包含1 065 bp的開放閱讀框，編碼354個氨基酸（圖 2）。

2.2 銀杏GbbHLH91編碼蛋白質特征性分析

GbbHLH91基因編碼354個氨基酸，在線工具ExPASy分析結果顯示，GbbHLH91基因編碼的蛋白質分子量為 40.1 kDa，等電點為8.20。蛋白質序列同源比對分析借助在線工具BLASTP（NCBI）和Align X（Vetctor NTI 11.5）完成。同源比對結果發現，GbbHLH91蛋白質與其他植物的bHLH蛋白質具有一定的相似性（圖 3）。其中，和無油樟（Amborella trichopoda， XP_006854151）、油松（Pinus tabuliformis， AJP_06244）、陸地棉（Gossypium hirsutum， XP_016753830）、可可（Thebroma cacao， EOY17565）、核桃（Juglans regia， EOY17565）、葡萄（Vitis vinifera， CAN77001）、蓖麻（Ricinus communis，XP_008347044）、蘋果（Malus domestic， XP_002534354）的bHLH蛋白質之間的一致性分別為60%、51%、51%、52%、51%、52%、50%、50%。比對結果顯示銀杏GbbHLH91與其它植物的bHLH蛋白質具有共同的保守域Helix-Loop-Helix，表明銀杏GbbHLH91屬于bHLH轉錄因子家族成員。

2.3 GbbHLH91基因系統進化分析

為了研究GbbHLH91基因的系統進化，本研究選取來自不同科屬的10個物種的bHLH氨基酸序列，利用軟件ClustalX 2.0和MEGA 6.0通過鄰接法（Neighbor-joining）構建了系統進化樹。系統進化樹結果顯示，進化樹分為裸子植物、被子植物門兩大分支（圖 4）。其中，銀杏GbbHLH91與同為裸子植物的松科植物油松（Pinus tabuliformis， AJP_06244）bHLH聚類在一個分支，表明在這些用于進化樹構建的蛋白質中，二者親緣關系相對更近。單子葉植物禾本科的玉米（Zea May， NP_001149299）、水稻（Oryza brachyantha， AAO00687）、節節麥（Aegilops tausc， EMT07628）親緣關系相對較近，聚類在同一個進化分支上；而雙子葉植物，如大戟科的麻風樹（Jatropha curcas， XP_012065727）、蓖麻（Ricinus communis， XP_002534354），薔薇科的蘋果（Malus domestic， XP_008347044）、白梨（Pyrus bretschneideri， XP_009373855），豆科的野生大豆（Glycine soja， KHN25939）、蒺藜苜宿（Medicago truncatula， XP_013457399）聚在另一大類。這些結果表明在基因的進化中，同科植物的bHLH基因進化關系較近，與植物本身之間的親緣關系一致，表明bHLH基因在進化過程中比較保守。

2.4 GbbHLH91基因的表達分析

利用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）測定了銀杏各組織和不同發育時期銀杏葉中GbbHLH91基因的表達水平。結果表明，GbbHLH91基因在銀杏各個組織中都有表達（圖5：A），其中GbbHLH91基因在銀杏葉中表達量最高， 根中表達量次之，在雄花、雌花和果中表達量較低，該結果說明GbbHLH91基因在銀杏各個組織中的表達量具有較大的差異性。GbbHLH91基因在不同發育時期的銀杏葉片中表達量也有差異（圖5：B），其中GbbHLH91基因的表達量在4月、5月表達量較高，并在4月中旬達到最大值，而后表達水平呈現逐漸下降趨勢。GbbHLH91基因表達量的差異可能與該蛋白質在銀杏中的分子功能有關。

3 討論與結論

bHLH轉錄因子是植物中的一大重要轉錄因子家族。本研究從銀杏中分離得到了GbbHLH91轉錄因子基因。前期研究表明，bHLH基因在植物體內可參與植物的生長發育、脅迫應答和次生代謝。目前，有關bHLH91轉錄因子的研究報道較少，擬南芥bHLH091在花藥中大量表達，可以與 bHLH010、bHLH089 結合，一起參與擬南芥花藥的生長發育（Zhu et al， 2015）。bHLH010/bHLH089/bHLH091主要通過與DYT1相互作用的反饋調節來調控擬南芥花藥的發育轉錄過程（Cui et al， 2016）。與擬南芥bHLH091基因的表達模式不同，本研究中，GbbHLH91基因在雄花中的表達量最低，而在葉中、莖中表達量相對較高。在不同發育時期的銀杏葉中，4月該基因的表達量較高，而此時也是銀杏雄花的發育時期。銀杏是童期非常長的一種植物，其開花調控機制可能存在著物種的特異性，推測bHLH91基因在銀杏和擬南芥中的具體調控功能或者調控方式可能不同。Bai et al（2011）研究發現，煙草bHLH基因NtAn1a和NtAn1b的異位表達能顯著提高煙草中花青素含量。在本研究中，GbbHLH91基因在銀杏的葉片中表達量最高，雄花中最低。另外，相對于其他組織而言，黃酮類化合物在銀杏葉中含量最高（高麗雅等，2007）；因此，GbbHLH91基因在銀杏葉片中表達量最高，推測該基因在銀杏中也可能與類黃酮的代謝合成有關。轉錄因子在植物抵抗逆境脅迫信號傳導過程中發揮著重要的作用。研究發現，一些植物bHLH轉錄因子不但參與植物的次生代謝，同時還參與響應植物的非生物脅迫。比如擬南芥AtbHLH61/93/122（Zhao et al， 2013； Liu et al， 2014）轉錄因子、水稻OrbHLH2（Zhou et al， 2009）、水稻 OsbHLH148（Seo et al， 2011）轉錄因子等。在剛毛檉柳中，ThbHLH1轉錄因子可以提高脅迫相關基因的表達從而來提高植物的抗性（Ji et al， 2016）。苦蕎FtbHLH3基因在擬南芥中表達，可以通過ABA信號途徑提高擬南芥抵御干旱脅迫的能力（Yao et al， 2017）。GbbHLH91基因在銀杏葉片、根中表達量較高，推測GbbHLH91轉錄因子可能在銀杏根部也參與響應了外界逆境脅迫。

總之，本研究克隆獲得了銀杏一個GbbHLH91轉錄因子基因，對該轉錄因子結構特點進行了分析；并分析了GbbHLH91基因在銀杏不同組織、不同發育時期銀杏葉中的表達情況，為進一步弄清GbbHLH91轉錄基因在銀杏中的調控功能奠定了基礎。

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