HPLC法測(cè)中藥“回陽液”中人參皂苷Rb1、Rg1、Re的含量研究

陳杰 馬世蓉 劉漢儒 張迎春 曾忠良

摘要：文章通過建立可同時(shí)測(cè)定中藥復(fù)方注射液回陽液中人參皂苷Rbl、Rgl、Re含量的高效液相色譜方法，以便為建立HYY的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。采用的方法是Agilent Zorbax SB-Cl8柱（4.6 mm×150 mm，5μm），以乙腈一水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 m L/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在本色譜條件下，人參皂苷Rbl、Rg1、Re分離度良好，系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)表明3種成分的檢測(cè)其線性關(guān)系良好（R2Rg1=0.999 2；R2Rb.=0.999 1；R2Re=0.999 5）；其精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好；人參皂苷Rb1、Re、Rg1的平均加樣回收率分別為97.5g%，101.32%和98.87%（RSD值分別為2.12%，1.77%，2.2g%），符合要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立的HPLC分析檢測(cè)方法可以用作復(fù)方中藥HYY的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：回陽液；反相高效液相色譜；人參皂苷；多組分測(cè)定

1 HYY概述

中藥復(fù)方回陽液（Huiyang Ye，HYY）是西南大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室自制，由人參、麥冬、甘草等味中藥組成。該制劑是基于臨床應(yīng)用，源于參附湯基礎(chǔ)上創(chuàng)制的主要用于臨床急救的新藥劑。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)確證該復(fù)方制劑HYY具有益氣養(yǎng)陰，回陽救逆，復(fù)脈固脫的功效，可用于治療因過勞、久瀉、大失血、敗血性感染疾病等表現(xiàn)的脈微欲絕、四肢厥逆、神志不清等癥候，對(duì)臨床表現(xiàn)的心衰、血壓過低或休克病理過程也具有良好的急救療效。

藥物以其安全性、有效性、穩(wěn)定性及質(zhì)量可控性決定了藥物本身的價(jià)值。盡管中藥，尤其是復(fù)方制劑的化學(xué)成分復(fù)雜，甚至有未知不確定性成分的存在，通常很難用質(zhì)量檢測(cè)手段對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面檢測(cè)。但對(duì)其主要藥效組成中藥的標(biāo)志性有效成分的質(zhì)量控制及其標(biāo)準(zhǔn)的研究，不僅可規(guī)范藥物制劑的生產(chǎn)管理，同時(shí)，也是保障藥物有效性和安全性的基本保證。

就中藥復(fù)方HYY來說，其君藥組成為人參（生曬參）。其所含有的人參皂苷是人參的主要活性成分，且人參價(jià)高。為了保汪制劑的質(zhì)量，強(qiáng)化生產(chǎn)過程的規(guī)范管理，保障制劑的有效性和安全性，有必要對(duì)其制劑中所含標(biāo)志性成分人參皂苷Rb1、Re、Rg1的含量進(jìn)行管控。因此，開展本實(shí)驗(yàn)，采用反相HPLC法檢測(cè)中藥復(fù)方注射液HYY中3種主要有代表性的皂苷Rb1、Re、Rg1的含量及控制標(biāo)準(zhǔn)的研究，可為該新制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)，為新制劑的申報(bào)注冊(cè)提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

日本島津高效液相色譜儀LC-20A島津液相色譜儀配有SPD-20A檢測(cè)器、LC-20AB泵、CTO-IOASvp柱溫箱、SHIM UV-2550紫外分光光度計(jì)；美國(guó)C18柱PLATISILTMODS（5μm，4.6×150 mm）；瑞士梅特勒公司電子分析天平AE240；重慶前沿水處理設(shè)備有限公司超純水儀QYSW-20A；昆山市超聲波儀器廠超聲波清洗儀KQ-250；上海齊欣科學(xué)儀器有限公司真空干燥箱DHP-9052。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

對(duì)照品人參皂苷Rbl、Re、Rgl均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水；其余試劑為分析純，市售；人參藥材購于重慶北碚和平大藥房；中藥復(fù)方回陽液（HYY）樣品（共10批）由西南大學(xué)藥學(xué)院中藥室自制。

2.2 色譜條件

固定相：C18柱PLATISILTM ODS （5μm.4.6×150 mm）。

流動(dòng)相A：水；B：乙腈。

梯度洗脫過程（v/v）：

0-25 min A： 81% B：19%

25-40 min A：

81%→63% B：19%→37%

40-45 min A： 63%→81% B：37%→19%

45-55 min A： 71%→60% B：19%

檢測(cè)波長(zhǎng)：203 mn；流速：1.0 mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μL

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱量人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品5 mg，加甲醇25mL制成質(zhì)量濃度0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

精密量取中藥復(fù)方HYY10 mL或者相同來源的人參藥材提取液，真空干燥箱揮干溶劑后加甲醇適量，超聲15min，離心，取上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇定容。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 線性關(guān)系的考察

精密吸取1.3.1配置好的人參皂苷Rb1、Rg1、Re混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5mL，按比例稀釋為6份不同濃度的人參皂苷混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。1.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

同一供試品溶液，按照1.2項(xiàng)下條件重復(fù)進(jìn)樣6次。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別取同一批次的人參（生曬參）提取液及中藥復(fù)方HYY各6份，每份5mL，依1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并在1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

制備好的供試品溶液，常溫放置，分別于Oh，6h，12 h，24h，36h，48h在1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。

2.4.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取己測(cè)含量的供試品溶液9份，每份6 mL，分成3組，每組分別加入人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL，1mL，2 mL，加甲醇定容到10 mL。1.3.2制備方法處理樣品后，按照2.2.1的色譜條件進(jìn)行含量的測(cè)定。

2.5 樣品測(cè)定

10批次HYY分別按1.3.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液各2份，共計(jì)20份樣品。按1.2項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。測(cè)定3種人參皂苷的色譜峰面積，并計(jì)算其含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC圖譜

在擬定的色譜條件下，3種人參皂苷分離度良好，如圖1～3所示。

3.2回歸方程的確定

經(jīng)計(jì)算，3種人參皂苷Rgl、Rbl、Re回歸方程分別是：

Yi=283 28ICI-27 497 （R2=0.999 2）

Y2=197 807C2-13 003 （R2=0.999 1）

Y2=327 512C3+119 485 （R2=0.999 5）

線性范圍分別是3.34-167μg/mL 4.58-229μg/mL3.66-183μg/mL。結(jié)果表明，此色譜條件下，峰面積與含量之間存在良好的線性關(guān)系。

3.3精密度實(shí)驗(yàn)

HYY供試品溶液中人參皂苷Rb1、人參皂苷Re及人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為2.02%，1.510/和1.83%。此結(jié)果說明此分析儀器的精密度良好。

3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

同一批HYY供試品溶液中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rbl峰面積的RSD分別是1.08%，0.9 8%，1.30%。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)建立的方法重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

HYY供試品溶液中3種人參皂苷峰面積的RSD值分別是2.68%，1.9 3%，2.37%。表明回陽液供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

3.6 加樣回收試驗(yàn)

計(jì)算得到人參皂苷Rb1，Re，Rg1的平均加樣回收率分別為97.5g%，101.32%和98.87%，其RSD值分別為2.12%，1.77%，2.2g%。結(jié)果表明，此實(shí)驗(yàn)方法加樣回收率良好，符合高效液相色譜的要求。

3.7 供試品溶液中3種人參皂苷的含量

供試品溶液中3種人參皂苷的含量如表1所示。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

10批回陽液中人參皂苷含測(cè)結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1、Rg1、Re的含量分別是（5.19±0.29μg/mL），（7.00±0.31μg/mL），（3.10±0.33μg/mL），其95%的可信限分別是4.80-6.39，7.79-8.27，2.16-3.48。3種人參皂苷的總量是（16.52±1.34μg/mL），其95%的可信區(qū)間是14.86-18.18。由此，可以此建立回陽液最低含量限量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

人參皂苷具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、強(qiáng)心升壓、改善心肌代謝、調(diào)血脂的作用，對(duì)心腦血管系統(tǒng)有良好的保護(hù)作用，這些功效與制劑功效吻合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥復(fù)方HYY中人參皂苷Rg1的含量最高，其次是Rb1，Rg1含量較少，這與組方中藥選用生曬參有關(guān)，與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道也基本一致。

人參皂苷Rgl和Re同屬于20 （s） -原人參三醇類，結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相近，在C18色譜柱中是最難分離的物質(zhì)對(duì)之一。本實(shí)驗(yàn)通過查閱文獻(xiàn)，篩選了大量HPLC法測(cè)人參皂苷的方法。通過篩選和對(duì)比，本實(shí)驗(yàn)最終建立了這種反相高效液相色譜法。該方法出峰時(shí)間短、峰形好、3種皂苷成分分離度大，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可操作性強(qiáng)，可以為中藥復(fù)方HYY質(zhì)量控制提供行之有效的參考方法。