HPLC—一測多評法同時測定大青葉中6種抗腫瘤活性成分的含量

羅文艷 段和祥 劉緒平 陳希 章瑛 李志勇

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）19-2635-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.10

摘 要 目的：建立同時測定大青葉中6種抗腫瘤活性成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters XTERRA? MS C18，流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL。以木犀草苷為內標，分別計算其與尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的相對校正因子（RCF），通過RCF計算大青葉中上述5種抗腫瘤活性成分的含量，同時采用外標法測定這6種成分的含量，比較一測多評法和外標法的含量測定結果。結果：尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素進樣量檢測線性范圍分別為0.122 6～4.902、0.063 4～2.534、0.032 7～1.309、0.038 2～1.527、0.032 3～1.291、0.052 5～2.098 ?g（r≥0.999 1）；檢測限分別為3.06、1.58、0.82、0.96、0.81、1.31 μg/mL，定量限分別為10.21、5.28、2.73、3.18、2.69、4.37 μg/mL；精密度、穩定性（24 h）、重復性試驗的RSD<2%（n=6）；加樣回收率為96.45%～99.14%（ RSD為0.8%～1.6%，n=6）。尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的RCF分別為0.197、0.413、0.732、0.825、0.587。在不同試驗條件下，RCF重現性良好。采用一測多評法和外標法的含量測定結果比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論：該方法操作簡單快捷、結果準確可靠，可用于大青葉中尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素6種抗腫瘤活性成分含量的同時測定。

關鍵詞 高效液相色譜法；一測多評法；大青葉；木犀草苷；抗腫瘤活性成分；相對校正因子

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 6 antitumor active constituents in Folium isatidis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Waters XTERRA? MS C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% formic acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 35 ℃， and detection wavelength was 254 nm. The injection volume was 10 μL. Using luteolin as internal standard， relative correction factors （RCF） of uridine， adenosine， hyperin， 7-methoxycoumarin and apigenin were calculated respectively. The contents of above 5 antitumor active components in F. isatidis were calculated by RCF. The contents of 6 components were determined by external standard method （ESM）. The results of content determination by QAMS were compared with ESM. RESULTS： The linear range was 0.122 6-4.90 2 ?g for uridine， 0.063 4-2.534 ?g for adenosine， 0.032 7-1.309 ?g for luteolin， 0.038 2-1.527 ?g for hyperin， 0.032 3-1.291 ?g for 7-methoxycoumarin， 0.052 5-2.098 ?g for apigenin（r≥0.999 1）. The limits of detection were 3.06， 1.58， 0.82， 0.96， 0.81， 1.31 μg/mL， respectively. The limits of quantification were 10.21， 5.28， 2.73， 3.18， 2.69， 4.37 μg/mL. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were less than 2% （n=6）. The average recoveries were 96.45%-99.14% （RSDs were 0.8%-1.6%， n=6）. RCFs of uridine， adenosine， hyperin， 7-methoxycoumarin and apigenin were 0.197， 0.413， 0.732， 0.825 and 0.587， respectively. RCFs repeatability was perfect under different experiment conditions. There was no significant difference between the quantitative results of the QAMS and ESM （P>0.05）. CONCLUSIONS： QAMS method is simple， fast， accurate and feasible， and can be used for simultaneous determination of uridine， adenosine， luteolin， hyperin， 7-methoxycoumarin and apigenin in F. isatidis.

KEYWORDS HPLC； QAMS； Folium isatidis； Luteolin； Antitumor active constituent； Relative correction factor

大青葉（Folium isatidis）為十字花科植物菘藍（Isatis indigotica Fort.）的干燥葉，具有清熱解毒、涼血消斑之功效，用于溫病高熱、神昏、發斑發疹、作腮、喉痹、丹毒、癰腫等的治療[1]。大青葉的化學成分主要有生物堿類、有機酸類、黃酮類、苷類、甾體類、氨基酸和無機元素等[2-4]。現代藥理研究表明，大青葉具有抗炎、抗病毒、解熱、增強免疫力、抗腫瘤、抗內毒素等作用[5-8]。大青葉中含有尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素等抗腫瘤成分。本研究建立了高效液相色譜（HPLC）-一測多評（QAMS）法同時測定大青葉中6種抗腫瘤活性成分的含量，以木犀草苷為內標，計算尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素與其之間的相對校正因子（RCF），利用RCF測定各成分含量，并將結果與外標法（ESM）測得數據進行比較分析，旨在為大青葉藥材質量控制和評價提供一種新的技術手段和依據。

1 材料

1.1 儀器

1260 Infinity ⅡHPLC儀，包括二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；Alliance e2695 HPLC儀，包括二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；色譜柱：Waters XTERRA? MS C18、Inerstsil ODS-3、ZORBAX Eclipse XDB-C18（均為250 mm×4.6 mm，5 μm）；MS205DU電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DS-8510DT超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

3批大青葉藥材購于樟樹康健中藥材有限公司，經江西省藥品檢驗檢測研究院中藥室萬林春副主任中藥師鑒定為十字花科植物菘藍（I. indigotica Fort.）的干燥葉。大青葉藥材來源詳見表1。

尿苷（批號：110887-200202，純度：100%）、腺苷（批號：110879-201703，純度：99.7%）、木犀草苷（批號：111720-201609，純度：94.9%）、金絲桃苷（批號：111521- 201708，純度：95.1%）、7-甲氧基香豆素（批號：111513- 200001，純度：100%）、芹菜素（批號：111901-201603，純度：99.2%）對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTERRA? MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～75 min，10%→64%A；75～80 min，64%→90%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素對照品適量，精密稱定，用70%甲醇溶液溶解并定量稀釋制成每1 mL中分別含上述對照品122.6、63.4、32.7、38.2、32.3、52.5 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取大青葉藥材10 g，剪碎，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz）提取45 min，取出，放冷，再稱定質量，用70%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm有機系微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 空白溶液 取70%甲醇溶液作為空白溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果，在該色譜條件下，各待測成分色譜峰都可以達到基線分離，各對照品色譜峰與相鄰峰之間分離度均>1.5，理論板數按木犀草苷峰計>3 000，詳見圖1。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、2、5、10、20、40 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以待測成分進樣量為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，結果見表2。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，根據色譜峰響應情況逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄各色譜峰。以信噪比為3 ∶ 1作為檢測限，以信噪比為 10 ∶ 1作為定量限。結果，尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的檢測限分別為3.06、1.58、0.82、0.96、0.81、1.31 μg/mL，定量限分別為10.21、5.28、2.73、3.18、2.69、4.37 μg/mL。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素峰面積的RSD分別為1.24%、1.08%、0.32%、1.55%、0.89%、1.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

精密量取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：170001）10 μL，分別于室溫下放置0、4、8、12、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素峰面積的RSD分別為0.27%、1.12%、1.47%、1.77%、1.65%、0.78%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取大青葉藥材（批號：170001）各約10 g，剪碎，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素含量的RSD分別為1.6%、1.1%、1.4%、0.8%、1.9%、1.2%（n=6），表明該方法的重復性良好。

2.9 加樣回收試驗

取大青葉藥材（批號：170001）約10 g，共6份，剪碎，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入一定量的各待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。由表3可見，各成分平均回收率為96.45%～99.14%。

2.10 QAMS法

2.10.1 RCF的計算 以木犀草苷為內標物，采用斜率校正法[9]，RCF計算公式為fk/s=ak/as[10-11]（a為回歸方程的斜率，s為內標物，k為其他待測組分），分別計算尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素與內標物木犀草苷的RCF。結果，尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的RCF分別為0.197、0.413、0.732、0.825、0.587。

2.10.2 RCF重現性考察 取“2.2.1”項下的混合對照品溶液和“2.2.2”項下供試品溶液，分別進樣10 μL測定分析，考察2個不同廠家的HPLC儀和3個不同品牌的色譜柱對RCF的影響，結果RSD均小于2.4%（n=6），表明在不同試驗環境下，該方法均具有較好的重現性。不同色譜儀和不同色譜柱條件下測得的fk/s結果見表4。

2.10.3 待測組分色譜峰的定位 在無對照品的條件下，準確定位每個色譜峰是QAMS法成功應用的關鍵，文獻[12]大都采用相對保留時間（rI/S）進行峰定位， rI/S=tR（I）/tR（S）[13-14]（tR為保留時間，I為待測成分，S為內標物）。本試驗以木犀草苷為內標物，采用相對保留時間結合化合物的紫外光譜特征來定位，計算2個不同廠家的HPLC儀和3個不同品牌的色譜柱的相對保留時間，結果RSD<2.7%（n=6），表明該方法重現性好。不同色譜條件下的相對保留時間結果見表5。

2.10.4 QAMS法與ESM法測定結果比較 取3批大青葉藥材，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備樣品，分別進樣10 μL測定，采用QAMS法與ESM法計算各成分含量，結果相對偏差（d）均<2.0%；同時，通過t檢驗對兩種方法所測含量結果進行比較，差異無統計學意義（P>0.05）。QAMS法與ESM法測定6種成分的含量結果見表6。

3 討論

3.1 質量控制指標的選擇

大青葉在抗菌、抗炎、抗病毒方面報道較多，在抗腫瘤方面關注較少，本試驗重點研究其抗腫瘤作用的活性成分。尿苷是合成很多抗腫瘤核苷類成分的前體[15]；腺苷在調節腫瘤細胞的生長和凋亡中起著關鍵作用[15-16]；木犀草苷對食管鱗狀癌 Eca109 細胞的生長有顯著抑制作用[17]；金絲桃苷能通過阻斷細胞周期、誘導細胞凋亡抗胃癌[18]；香豆素抗腫瘤活性具有高效低毒的特點，在香豆素7位連接適當長度的基團能顯著增強抗腫瘤活性[19]；芹菜素對肺癌細胞的抗增殖作用和抗腫瘤藥物的增敏作用良好[20]。大青葉藥材中含有以上6種成分，且都對腫瘤細胞有一定的抑制作用，因此選取上述6種成分作為大青葉質量控制的指標。

3.2 流動相的選擇

筆者也曾比較了甲醇-水、乙腈-水兩種流動相，發現甲醇-水作為流動相洗脫效果明顯優于乙腈-水。在甲醇-水的基礎上進一步考察了含0.1%甲酸的甲醇、0.1%醋酸的甲醇、0.1%醋酸銨的甲醇、0.1%磷酸的甲醇，發現含0.1%甲酸的甲醇作為流動相洗脫效果最佳，各峰分離度均>1.5，故本試驗最終選取甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

3.3 檢測器的選擇

筆者在190～400 nm波長范圍內對6種成分進行紫外掃描，發現各成分均有紫外吸收。但由于各成分的最大吸收波長不同，為便于在試驗過程中觀察各成分峰在不同波長處的響應值及分離度情況，本試驗最終選擇二極管陣列檢測器進行試驗。

3.4 檢測波長的選擇

本試驗采用二極管陣列檢測器，在190～400 nm波長范圍內對混合對照品溶液中的待測成分進行了全波長掃描，獲得尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素、芹菜素的最大吸收波長分別為261、258、254、255、323、337 nm，6種成分中有4種成分的最大吸收波長集中在254 nm附近，2種成分的最大吸收波長在330 nm附近。若檢測波長設定為330 nm，則對腺苷、尿苷和金絲桃苷色譜峰響應值的影響較大；若檢測波長設定為254 nm，則對7-甲氧基香豆素和芹菜素色譜峰響應值的影響較小。以木犀草苷的最大吸收波長254 nm作為檢測波長，能兼顧各成分色譜峰的峰高與分離度，故本試驗最終選取木犀草苷的最大吸收波長254 nm作為檢測波長。

3.5 內標的選擇

筆者采用ESM法計算6種成分的含量時發現，木犀草苷的含量較其他5種成分高，可獲得性強，以木犀草苷為內標，建立其與尿苷、腺苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素的RCF。在不同色譜儀和不同色譜柱中RSD均小于2.4%，相對保留時間RSD小于2.5%。采用QAMS法與ESM法同時檢測3批大青葉藥材中6種活性成分的含量，相對偏差小于2.0%。故本試驗選擇木犀草苷作為內標進行QAMS分析。

綜上所述，本文建立的含量測定方法操作簡單快捷、結果準確可靠，可用于大青葉中尿苷、腺苷、木犀草苷、金絲桃苷、7-甲氧基香豆素和芹菜素6種抗腫瘤活性成分含量的同時測定。

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（收稿日期：2018-06-28 修回日期：2018-08-21）

（編輯：余慶華）