葡萄葉片表皮氣孔與霜霉病的抗性研究

杜蕙 蔣晶晶 王春明 郭建國 漆永紅

摘要：采用室內離體接種結合田間自然發病調查，研究了8個葡萄品種對霜霉病的抗性，結果表明，不同品種對葡萄霜霉病的抗性差異較大，高妻、夏黑、醉人香及矢富羅莎對霜霉病表現抗病（R），奧古斯特、紅地球及貴妃玫瑰對霜霉病表現感病（S），瑞比爾表現高感（HS）。對8個葡萄品種的葉片表皮氣孔觀察表明，不同品種葉片氣孔大小、密度不同。氣孔密度由大到小依次為奧古斯特、矢富羅莎、夏黑、貴妃玫瑰、高妻、醉人香、紅地球、瑞必爾。氣孔的開張面積從大到小依次為醉人香、高妻、貴妃玫瑰、紅地球、夏黑、奧古斯特、瑞必爾、矢富羅莎。各品種葉片氣孔的密度及大小與霜霉病的抗性未表現出一定規律。

關鍵詞：葡萄;葉片表皮氣孔;霜霉病;抗性

中圖分類號：S436.631.1? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ?文章編號：1001-1463（2018）12-0058-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.12.017

葡萄霜霉病是由葡萄生單軸霉菌[Plasmopara.viticola]引起的葡萄生產上最重要的病害之一，世界各地葡萄產區均有發生，是一種世界性病害[1 - 2 ]。我國1899 年發現該病危害[3 ]，目前幾乎所有葡萄產區都有發生，潮濕多雨地區危害更為嚴重，發病嚴重時嚴重影響樹勢和果實品質[4 ]。目前關于葡萄霜霉病的抗性研究主要集中在品種抗病性鑒定、病菌致病性分化及抗藥性等方面 [5 - 9 ]，有學者對與抗性有關的葡萄葉片組織結構進行了研? ? 究[10 - 13 ]，但不同學者的研究結果不同。我們以生產中主栽的鮮食葡萄品種為材料，觀察了不同葡萄品種對霜霉病的抗性及葉片表皮的氣孔，以期豐富葡萄霜霉病抗性機理研究。

1? ?材料和方法

1.1? ?試驗材料

植物材料為葡萄室內盆栽苗，品種有：紅地球、夏黑、高妻、瑞必爾、醉人香、貴妃玫瑰、奧古斯特、矢富羅莎。普通型塑料透明膠帶，寬度為 18 mm，厚度為0.05 mm。

供試葡萄品種于2013年秋季扦插于甘肅省農業科學院植物保護研究所溫室中。2014年8月從田間采集新鮮的葡萄霜霉病的葉片，用自來水反復沖洗掉老孢子囊后，在20 ℃條件下黑暗保濕培養24～48 h。待新孢子囊長出后用毛筆刷下，用無菌水配制成濃度為1×105～1×106個/mL孢子囊懸浮液備用。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 供試品種對霜霉病的抗性評價? ? 采用室內離體葉片法結合田間自然發病調查進行品種抗性評價。室內離體葉片測定時，分別采集供測試葡萄品種新梢大小和葉齡基本一致的健康葉片，將事先準備好的孢子囊懸浮液用喉頭噴霧器在葉片背面均勻噴灑10 mL，然后將葉片正面朝下放在鋪有四層無菌水浸濕滅菌紗布的瓷盤中，為避免葉片與濕紗布接觸腐爛，在葉片下放置玻璃棒，葉柄用脫脂棉保濕，磁盤用保鮮膜覆蓋密封，于20 ℃條件下黑暗保濕培養。以噴等量清水為對照，每品種接種10片葉，重復3次。逐日觀察記錄發病情況，用接種后第7天的調查數據計算病情指數。

田間自然發病調查參考劉天明等[13 ]的方法。2014年，在甘肅省農業科學院林果花卉研究所葡萄園分別在霜霉病初發期（7月5日）、盛發期（8月16日）及發病后期（9月22日）共進行3次調查。每品種選取20個新發的枝條，每枝自上而下調查10個葉位相同葉片，記錄發病情況，計算平均病情指數。室內及田間病害調查分級方法按0級，無病斑;1級，病斑面積占葉面積5%以下;3級，病斑面積占葉面積6%～25%;5級，病斑面積占葉面積26%～50%;7級，病斑面積占葉面積? ? ?51%～75%;9級，病斑面積占葉面積76%以上進行。品種抗性評價參考劉新秀等[14 ]的5級分級法，即免疫（I），病情指數為0;高抗（HR），病情指數為0.1～5.0;抗病（R），病情指數為5.1～25.0;感病（S），病情指數為25.0～50.0;高感（HS），病情指數為50.0～100.0。

1.2.2? ? 不同葡萄品種葉片表皮氣孔壓片制作? ? ?采用透明膠帶粘取法[15 ]。塑料透明膠帶拉開10～15 cm，膠面朝上，平放在實驗臺面上。帶葉柄剪取葡萄葉片（第3～5片新葉），用水輕輕沖洗后用濾紙迅速吸干表面水分。左手捏住葉柄，將葉片正面粘在膠帶上。在粘貼過程中，先將葉尖粘貼在膠帶上，然后將葉片向葉背面彎曲逐漸向前推移，使葉片正面與膠帶充分接觸。為了防止粘貼過程中葉片皺縮，應右手持解剖針，置于葉片與膠帶之間進行調整，使葉片平整地粘貼在膠帶上。然后剪去葉柄。將膠帶對折過來平整地粘貼在葉片的背面。然后用手指對捏膠帶，使膠帶與葉片兩面充分粘著。將對折的膠帶撕開，葉片正面仍緊密粘貼在膠帶上，葉片背面與膠帶分離，并將葉片下表皮粘貼在膠帶上。若葉面附著物較多，膠帶不能與表皮緊密粘著時，可用膠帶連續重復粘貼葉片，直到粘去附著物后，粘取下表皮。為了防止粘取的表皮材料相互重疊，在連續重復粘貼時應更換膠帶新的部位粘著表皮。

將帶葉片下表皮的膠帶沿表皮輪廓剪成 3～5 mm × 3～5 mm 的矩形片。在載玻片上滴1滴蒸餾水、1滴 1% 的碘-碘化鉀染液，將帶葉片表皮的膠帶膠面向下置載玻片上染色 0.5～1.0 min，蓋上蓋玻片，壓平后即制成氣孔壓片。

1.2.3? ? 不同葡萄品種葉片表皮氣孔測定? ? 將制好的氣孔壓片在40倍光學顯微鏡下觀察，每品種分別觀察5張制片，分別量取50個氣孔的縱徑、橫徑，求其平均值。

氣孔數目測定：在顯微鏡下數得每1視野中氣孔的數目，計算10個視野的平均值。

氣孔開張面積計算：S=縱徑×橫徑× 3.14 × 0.25（單位μm2）。

氣孔密度計算：氣孔數/mm2 =視野氣孔數/視野面積。

視野面積計算：S=πr2（r為視野半徑）。

1.3? ?數據分析

試驗數據用EXCEL2003進行統計分析。

2? ?結果與分析

2.1? ?不同葡萄品種對霜霉病的抗性

通過室內離體接種結合田間自然發病調查，供試品種對葡萄霜霉病的抗性評價結果見表1，高妻、夏黑、醉人香及矢富羅莎對霜霉病表現抗病（R），奧古斯特、紅地球及貴妃玫瑰對霜霉病表現感病（S），瑞比爾表現高感（HS）。各品種在室內接種條件下病情指數均高于田間自然發病的病情指數，可室內離體接種所提供的環境條件更有利于霜霉病的發生。

2.2? ?不同葡萄品種葉片表皮氣孔觀察

通過對不同品種葡萄葉片表皮氣孔壓片的觀察，發現葡萄葉片表皮有大量氣孔存在。8個品種氣孔密度在55～99個/mm2，不同品種葉表皮氣孔數量差異較大。單位面積氣孔數量由多到少的順序為奧古斯特、矢富羅莎、夏黑、貴妃玫瑰、高妻、醉人香、紅地球、瑞必爾。氣孔的開張面積從大到小的順序為醉人香、高妻、貴妃玫瑰、紅地球、夏黑、奧古斯特、瑞必爾、矢富羅莎。

3? ?結論與討論

通過室內離體接種結合田間自然發病調查，8個葡萄品種對霜霉病的抗性不同。高妻、夏黑、醉人香及矢富羅莎對霜霉病表現抗病，奧古斯特、紅地球及貴妃玫瑰對霜霉病表現感病，瑞比爾表現高感。對不同品種葡萄葉片表皮氣孔觀察表明，奧古斯特葉表皮氣孔密度最大，其次為矢富羅莎、夏黑、高妻、貴妃玫瑰、醉人香、紅地球及瑞比爾。從氣孔的大小看，醉人香氣孔最大，其次為高妻、貴妃玫瑰、紅地球、夏黑、奧古斯特、瑞必爾及矢富羅莎。

植物的一些結構特征，如角質層、氣孔、葉片茸毛等均對病原物的侵入表現出一定的抗性。關于氣孔在抗霜霉病中的作用， 不同學者有不同看法。王國英[11 ]的研究認為葡萄對霜霉病的杭性與葉片氣孔的密度有極顯著的關系。感病類型葉片氣孔密而大，抗病類型葉片氣孔少，且氣孔周圍有白色堆積物。一旦病菌從氣孔侵入后，很快會產生孢囊梗和孢子囊，氣孔就不能再關閉，從而不僅奪取寄主的營養，還會使蒸騰作用明顯增強，這與吉麗麗[10 ]的研究結果一致。但劉天明[13 ]等認為氣孔大小、密度及晝夜開閉程度與葡萄抗感病性無關，且氣孔密度、氣孔橫徑、氣孔縱徑與病級間也無顯著相關性。Boubals D. [16 ]認為，氣孔在抗病性中的作用很小，但氣孔保衛細胞死亡會導致游動孢子萌發管以及菌絲體的死亡。關于氣孔大小的劃分界限，不同研究者有不同的標準。 我們將保衛細胞縱徑大于30 μm的定為大氣孔，15～30 μm的定為普通氣孔，小于15 μm者為小氣孔。據此，8個品種中只有瑞比爾和矢富羅莎的氣孔屬于小氣孔，其他6個品種的氣孔均屬于普通氣孔，且透明膠帶粘取法觀察植物氣孔的方法操作簡單、方便，能較好地反映氣孔的大小。

本試驗表明，氣孔的密度及大小與霜霉病的抗性無直接關系。如較抗霜霉病的品種高妻，其氣孔大小、氣孔密度均高于高感霜霉病的品種瑞比爾，其他品種對霜霉病的抗性與其氣孔大小及密度間也無規律可循。李華[12 ]認為葉片氣孔對游動孢子向性引力大小，也是構成葡萄對霜霉病抗性的主要因素。抗病品種葉片上可侵入的孢子數目顯著低于感病品種， 而感病品種葉片的氣孔比抗病品種對游動孢子有更大的向性引力。葡萄對霜霉病的組織結構抗性是多種多樣的，氣孔僅為葡萄霜霉病菌進入葉片組織的通道。本研究僅對8個葡萄品種進行了研究，探究氣孔與葡萄對霜霉病抗性的關系還需進行更多品種、更深入的研究。

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（本文責編：陳? ? 珩）