白花香蓮解毒顆粒對HBV全基因組1.3倍體細胞模型病毒復(fù)制與表達的影響*

邱 華 毛德文△ 龍富立 劉雪梅 王明剛 李 媛 李家煥 蘇翠麗

1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 (廣西 南寧，530023)2.廣西中醫(yī)藥大學

我國屬HBV感染中-高流行區(qū)，現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎(CHB)患者約2000萬例[1]。雖然最新的調(diào)查顯示我國HBsAg檢出率呈下降趨勢，但總體而言，CHB仍然是影響我國人民身體健康、社會發(fā)展及穩(wěn)定的重大傳染病之一[2]。白花香蓮解毒顆粒是在壯醫(yī)“毒虛致病”理論指導(dǎo)下，凝練而成的抗HBV特色壯藥。前期臨床研究表明，其聯(lián)合阿德福韋酯治療HBeAg陽性CHB患者能提高HBV DNA陰轉(zhuǎn)率，增加HBeAg的血清學應(yīng)答率及轉(zhuǎn)換率[3～5]。體外實驗已證實其能抑制HepG2.2.15模型的HBV的復(fù)制與表達[6，7]。本研究將在課題組所構(gòu)建的HBV 1.3P模型上，進一步評估白花香蓮解毒顆粒的抗HBV作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2細胞(中國科學院上海細胞生物研究所)，MEM培養(yǎng)基(41500034，GIBCO)，Opti-MEM(31985，GIBCO)，DMEM培養(yǎng)基(SH30023.01B，HyClone)PVDF超濾膜(RC05290A，Sigma)，CCK-8試劑盒(CA1210，Solarbio)，PCR相關(guān)試劑盒(KK4610，KAPA)，0.05% Trypsin(25200-072，IVGN)，F(xiàn)BS(S1810-500，Biowest南美血源)，Mouse Anti-HBsAg(H2F4)antibody (bsm-2024M，Gentaur)，Anti-Mouse IgG H&L (PE/Cy5.5)preadsorbed (ab130784，Gentaur)。HBsAg、HBeAg化學發(fā)光法檢測試劑盒(鄭州安圖生物工程股份有限公司)。PCR引物合成和測序由金唯智生物科技有限公司完成。去乙酰車葉草酸甲酯對照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-16101706，供含量測定用)，美國Agilent HP1260高效液相色譜儀。余姚市金偌天平儀器有限公司YP5000型電子天平。水為超純水，乙腈為色譜純試劑。白花香蓮解毒顆粒由白花蛇舌草30g、黃花倒水蓮15g、三葉香茶菜20g、排錢草15g四味壯藥組成，由我院藥劑科統(tǒng)一購入，并經(jīng)我校中藥(民族藥)鑒定專家夏星教授甄別。

1.2 方法

1.2.1 白花香蓮解毒顆粒制備工藝 以去乙酰車葉草酸甲酯的含量和得膏率為考察指標，以加水倍量、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，采用L9(34)正交試驗方法確定白花香蓮解毒顆粒的最佳提取工藝為：處方藥材加10倍水加熱回流提取2次，每次1.5h，合并兩次濾液，濾液濃縮至相對密度1.20～1.25(50～60℃)稠膏。稱取稠膏重量，按稠膏∶糊精=1∶2比例加入糊精，按阿斯巴甜∶甜菊糖苷(1∶1)加入0.5%矯味劑，再加入75%乙醇做潤濕劑，以上各輔料混合均勻，過14目篩制粒，80℃鼓風干燥后14目篩整粒，即可。在制劑的稠膏階段取出壯藥稠膏100g，冷藏備用。

1.2.2 白花香蓮解毒顆粒的去乙酰車葉草酸甲酯含量測定

精密稱取去乙酰車葉草酸甲酯對照品適量，置10ml容量瓶中，用流動相稀釋并超聲溶解至刻度，搖勻，即得1.014mg/ml的去乙酰車葉草酸甲酯標準溶液，作為儲備液。精密吸取去乙酰車葉草酸對照品儲備液0.20ml于10 ml容量瓶中，用流動相溶解稀釋至刻度，得濃度20.28μg/ml的對照品溶液。精密吸取去乙酰車葉草酸對照品儲備液0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40ml于 10 ml容量瓶中，用流動相溶解稀釋至刻度，得濃度為5.071、10.14、15.21、20.28、30.42、40.56μg/ml的標準品溶液。精密稱取白花香蓮解毒顆粒稠膏0.3g加至25ml的容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度。搖勻，濃縮液過0.22μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液，上述對照品溶液、標準品溶液、供試品溶液按色譜柱 Inertsil ODS-3(4.6×250mm，5μm)；流動相乙腈∶水(9∶91)；檢測波長238nm；柱溫30℃；流速0.85ml/min；進樣量5μl進行色譜分析。

1.2.3 白花香蓮解毒顆粒細胞干預(yù)液的制備 取備用的白花香蓮解毒顆粒稠膏4g，加入無菌純水中充分溶解后，定容到40ml，濃度相當于0.1g稠膏/ml。依次經(jīng)濾紙及0.45μM孔徑、0.22μM孔徑PVDF超濾膜過濾后，取100μL加入1.9mL MEM完全培養(yǎng)基中，配置成5mg稠膏/ml(以下簡稱為mg/ml，均為稠膏量)的白花香蓮解毒顆粒細胞干預(yù)液。采用MEM完全培養(yǎng)基進行梯度稀釋，5mg/ml(1倍)、2.5mg/ml(1/2倍)、1.25mg/ml(1/4倍)、0.625mg/ml(1/8倍)、0.32mg/ml(1/16倍)、0.16mg/ml(1/32倍)、0.08mg/ml(1/64倍)、0.04mg/ml(1/128倍)。

1.2.4 CCK-8法檢測白花香蓮解毒顆粒對HBV 1.3P細胞生長的影響

1.2.4.1 細胞鋪板數(shù)量及CCK-8孵育時間的確定 96孔板內(nèi)每孔鋪HBV 1.3P細胞數(shù)0、1000、2000、4000、6000、8000、10000、12000，各3個復(fù)孔。細胞貼壁后，加入CCK-8液。37℃分別孵育1h、2h、3h，490nm波長檢測OD讀值。繪制出標準曲線，確定出最佳細胞鋪板數(shù)、孵育時間。

1.2.4.2 CCK-8檢測白花香蓮解毒顆粒對HBV 1.3P細胞增殖的影響 選擇對數(shù)生長期的HBV 1.3P細胞，收集細胞，記數(shù)，按照預(yù)實驗的最佳鋪板數(shù)鋪板，設(shè)置3個對照孔，邊緣孔用PBS補充，5%CO2，37℃，孵育過夜，設(shè)置空白對照組(只加MEM完全培養(yǎng)基)；按照藥物不同的濃度加藥，每組進行3重復(fù)，繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別在0h、3h、6h、12h、24h、48h和72h，加入CCK-8 10μl/孔，孵育2h(由預(yù)實驗確定)，酶聯(lián)免疫檢測儀測量OD490。各組以空白對照組時間點為對照，計算每個不同濃度白花香蓮解毒顆粒干預(yù)組每個時間點相對生長速度，根據(jù)生長曲線計算細胞的數(shù)量及細胞增殖抑制率。

1.2.5 白花香蓮解毒顆粒干預(yù)HBV復(fù)制的最佳濃度與時間確定 將制備成功的HBV 1.3P細胞模型分為干預(yù)24h組，干預(yù)48h組，然后根據(jù)CCK-8結(jié)果，加入不同濃度的白花香蓮解毒顆粒細胞干預(yù)液，實驗結(jié)束后收取各組細胞及上清液。

1.2.6 qPCR檢測HBV DNA的水平 將收集到各組HBV 1.3P細胞，抽提總DNA，采用qPCR檢測HBV DNA的表達水平，HBV DNA的檢測引物為(F：CTCGTGGTGGACTTCTCTC，R：CAGCAGGATGAAGAGGAA)；以18S rDNA為內(nèi)參，檢測引物為(18S-F：GAATTGACGGAAGGGCACCAC，18S-R：AAGAACGGCCATGCACCACCA)。實驗組與對照組中基因的倍數(shù)關(guān)系通過公式R=2-ΔΔCt計算，qPCR產(chǎn)物的特異性通過擴增曲線和溶解曲線來檢測。反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 10μl、引物F(10mM)1 μl、引物R(10mM)1 μl、模板 1 μl、RNase-free H2O 5μl；反應(yīng)條件：95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，40個循環(huán)，PCR數(shù)據(jù)采集。HBV DNA抑制率=(1-待測樣品相對表達量值)×100%。

1.2.7 化學發(fā)光法檢測細胞內(nèi)HBsAg、HBeAg的表達量 參照前期方法[8]，將收集到的各組HBV 1.3P細胞上清液，按HBsAg、HBeAg化學發(fā)光法試劑盒的說明書實施檢測，為了減少因細胞數(shù)量對檢測結(jié)果的影響，實驗按4×105個細胞量計算發(fā)光強度。

1.2.8 間接免疫熒光法檢測細胞內(nèi)HBsAg的表達水平 收集各組HBV 1.3P細胞，消化細胞，將細胞爬片，爬片后的細胞用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，0.25% Triton X-100/PBS孵育5min通透細胞，PBS洗2次；10% BSA/PBS，37℃下孵育30min，用3%BSA/PBS稀釋第一抗體，37℃下孵育2h，PBS洗復(fù)3次，3%BSA/PBS稀釋第二抗體，37℃下避光孵育45min，PBS 3次；熒光顯微鏡觀察并拍照，每張玻片拍攝5張(4個邊角及片中央)，將熒光顯微鏡拍下的照片用Image-Pro Plus軟件計算平均光密度(Mean IOD)，分析熒光的強弱。

2 結(jié)果

2.1 白花香蓮解毒顆粒稠膏中去乙酰車葉草酸甲酯的含量 以峰面積(A)為縱坐標，以對照品濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，計算得去乙酰車葉草酸甲酯的回歸曲線方程如下：A=11.45333C+1.01567(R=0.99994)。對照品溶液測定結(jié)果見圖1A，供試品溶液測定稠膏中去乙酰車葉草酸甲酯的峰面積為170.9，稠膏中去乙酰車葉草酸甲酯的含量為1.23mg/g，并作為白花香蓮解毒顆粒制劑的質(zhì)量標準，見圖1B。

A 對照品溶液

B 供試品溶液

2.2 CCK-8實驗最佳檢測時間與最佳鋪板細胞數(shù) 結(jié)果顯示，不同數(shù)量的各組細胞數(shù)均在孵育2h時其OD值達到最高水平(圖2A)，選擇孵育2h為CCK-8實驗的最佳檢測時間；在2000～12000細胞數(shù)范圍內(nèi)OD值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(圖2B)，Y = 0.00006X + 0.16392(Y為OD值，X為細胞數(shù))。

圖2 CCK-8孵育時間及細胞數(shù)與OD值的關(guān)系圖

2.3 CCK-8實驗測定白花香蓮解毒顆粒對HBV1.3P細胞增殖的影響 與空白對照組比較，白花香蓮解毒顆粒在0.04～0.625mg/ml對HBV1.3P細胞增殖無明顯抑制作用。在1.25～5mg/ml范圍內(nèi)，白花香蓮解毒顆粒則會抑制HBV1.3P細胞的增殖，抑制率隨濃度而升高，其中5mg/ml在干預(yù)72h后細胞增殖抑制率達到了(71.2±2.95)%。(見圖3)。

圖3 白花香蓮解毒顆粒對HBV1.3P細胞增殖率的影響圖

2.4 白花香蓮解毒顆粒對HBV1.3P細胞HBV DNA復(fù)制的影響 在相同干預(yù)時間條件下，白花香蓮解毒顆粒對HBV DNA抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)關(guān)系，而由于CCK-8實驗提示1.25mg/ml條件下對細胞增殖具有一定抑制作用，因此選擇0.625mg/ml為最佳濃度。在相同藥物濃度條件下，白花香蓮解毒顆粒對HBV DNA抑制率與干預(yù)時間呈正相關(guān)關(guān)系，其中最佳濃度0.625mg/ml干預(yù)48h時HBV DNA抑制率為(42.92±2.42)%，優(yōu)于干預(yù)24h的(35.36±9.16)%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度白花香蓮解毒顆粒對HBV DNA復(fù)制的抑制率 (%)

與同組干預(yù)24h時相比，*P<0.05

2.5 白花香蓮解毒顆粒對HBV1.3P細胞上清液HBsAg、HBeAg表達量的影響 在干預(yù)48h情況下，HBV1.3P細胞上清液中HBsAg、HBeAg表達量與白花香蓮解毒顆粒濃度呈負相關(guān)關(guān)系。見表2。

表2 不同濃度白花香蓮解毒顆粒對HBV1.3P細胞上清HBsAg、HBeAg表達量的影響

與0.625mg/ml組比較，*P<0.05

2.6 白花香蓮解毒顆粒對HBV1.3P細胞HBsAg表達強度的影響 在干預(yù)48h情況下，HBV1.3P細胞HBsAg表達強度與藥物濃度呈負相關(guān)關(guān)系。0.625mg/ml組HBsAg表達強度與0.04mg/ml、0.08mg/ml組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表3。

表3 不同濃度白花香蓮解毒顆粒對HBV1.3P細胞HBsAg表達量的影響比較

與0.625mg/ml組比較,**P<0.01

3 討論

抗病毒是慢性乙型肝炎治療的關(guān)鍵，目前核苷(酸)類似物、干擾素等抗病毒藥物在實現(xiàn)抑制HBV DNA復(fù)制的基本目標上已能獲得比較滿意的療效，然而在達到理想目標即HBsAg血清學轉(zhuǎn)換、滿意目標即HBeAg血清學轉(zhuǎn)換方面仍然比率較低。因此，在深入研究HBV和宿主相互關(guān)系的基礎(chǔ)上，尋找更有效、安全的治療方法，仍是當前國內(nèi)、外肝病學者亟待解決的難題。

在我國，中醫(yī)藥是治療CHB的一種重要手段，其在保肝降酶、抗肝纖維化、調(diào)節(jié)免疫及抗病毒等方面具有較好的療效。針對HBV抗病毒治療低HBeAg、HBsAg血清學轉(zhuǎn)換率的臨床難題，由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院葉永安教授、廣州中醫(yī)藥大學深圳附屬醫(yī)院周大橋教授領(lǐng)銜的國家“十一五”、“十二五”科技重大傳染病專項進行了深入研究。其中葉永安教授主持的項目對590例HBeAg陽性CHB患者進行了為期48周的臨床研究，試驗組使用中藥聯(lián)合阿德福韋酯，對照組使用中藥安慰劑聯(lián)合阿德福韋酯。結(jié)果證實，試驗組治療48周時HBeAg應(yīng)答率為29.64%，對照組為17.86%，提高HBeAg應(yīng)答率達11.78%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同時研究發(fā)現(xiàn)試驗組24～48周的HBV DNA下降率高于對照組[9]。周大橋教授主持的項目對300例HBeAg陽性HBV攜帶者進行為期52周的抗病毒療效觀察，治療組患者(200例)給予補腎健脾方治療，對照組患者(100例)給予中藥安慰劑治療。結(jié)果治療52周時治療組患者血清HBV DNA 水平明顯下降，與0周及安慰劑對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中治療組HBV DNA下降>1 log及>2 log的比例分別為45.98%、21.84%，明顯高于對照組的11.83%、5.38%。治療過程中，治療組患者HBeAg均值、HBsAg均值均呈持續(xù)下降趨勢。52周時，治療組患者HBeAg均值、HBsAg均值下降均顯著優(yōu)于安慰劑對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)[10]。上述研究結(jié)果從循證醫(yī)學層面證實，中醫(yī)藥確能提高HBeAg陽性CHB或攜帶者的HBeAg血清學轉(zhuǎn)換率，是一種切實可行的新途徑。

本課題組前期多中心臨床研究證實，白花香蓮解毒方(顆粒)聯(lián)合阿德福韋酯膠囊治療HBeAg陽性的CHB患者48周，其HBV DNA陰轉(zhuǎn)率提高24.31%，生化學應(yīng)答率提高7.8%，臨床綜合療效優(yōu)于單純阿德福韋酯對照組(P<0.05)。在HBeAg/抗-HBeAb血清學應(yīng)答率與陰轉(zhuǎn)率方面，治療24、48 周試驗組HBeAg 血清應(yīng)答率分別為26.27%、39.83%，對照組為13.68%、29.06%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療48周，試驗組HBeAg陰轉(zhuǎn)率為22.03%，對照組為11.96%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其機制與降低CHB患者CD4+CD25+Treg細胞比率，突破免疫耐受，恢復(fù)機體對HBV的特異性CTL免疫應(yīng)答有關(guān)[4，5]。HBV1.3P細胞模型包含了HBV基因組的5’末端Enh Ⅰ、Enh Ⅱ，復(fù)制起始區(qū)(DR1、DR2)，前基因組轉(zhuǎn)錄起始位點X 和前C 區(qū)啟動子，X 開放閱讀框等構(gòu)件，能依賴自身啟動子啟動轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，且以cccDNA 為復(fù)制模板，復(fù)制和表達效率高于1.1 和1.2 倍體的模型，其較傳統(tǒng)將HBV 基因組整合入HepG2細胞基因的HepG2.2.15模型等更適合于中藥/壯藥抗HBV的療效評估[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，白花香蓮解毒顆粒不僅能直接抑制HBV1.3P細胞模型的HBV DNA復(fù)制，而且能顯著下調(diào)HBeAg、HBsAg的表達量，從而提示該藥物除了能通過免疫調(diào)控途徑外，還可能在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、蛋白成熟、蛋白分泌等環(huán)節(jié)上直接干擾HBV復(fù)制與表達，其具體機制有待深入研究。