海珠益肝加味方對免疫性肝損傷小鼠的防護(hù)作用*

徐建良 盛國光 張?jiān)瞥?楊 妮

1.湖北省中醫(yī)院肝病科 (湖北 武漢，430061)2.湖北省中醫(yī)藥研究院 3.深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院 4.湖北中醫(yī)藥大學(xué)2018級碩士研究生班

慢性乙型病毒性肝炎(CHB)是由HBV感染引起的免疫性疾病，導(dǎo)致肝臟損傷的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全清楚。Con A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷模型具有肝臟特異性、劑量依賴性和制作簡便快捷的特點(diǎn)[1]，被認(rèn)為是最適合研究人類病毒性肝炎病理機(jī)制的研究模型。海珠益肝加味方是盛國光教授治療CHB的經(jīng)驗(yàn)方，在前期的臨床及實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)其具有抑制乙肝病毒復(fù)制、恢復(fù)肝功能、抗肝纖維化等作用[2，3]，但其機(jī)制尚不十分明確。本實(shí)驗(yàn)從免疫性肝損傷的角度，探討海珠益肝加味方對免疫性肝損傷小鼠防護(hù)作用及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠40只,清潔級，5周齡，雄性,體重18～22g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.1.2 主要藥物及試劑 海珠益肝加味方組成：葉下珠、海藻、太子參、枸杞子、白花蛇舌草各15g，茯苓12g，白芥子10g，莪術(shù)6g，均購自湖北省中藥材公司。按處方加水煎煮兩次，混合藥液，沉淀過濾，水浴濃縮為含生藥1g/ml的藥液,分裝、滅菌、低溫保存，由湖北省中醫(yī)院制劑室提供。醋酸強(qiáng)的松片由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)(批號H33021207),以生理鹽水溶解成0.78mg/ml溶液；Con A購自Sigma公司(批號80M7680V)；ALT、AST、SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所;IL-4、IL-6試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自谷歌生物(批號G2003)；牛血清白蛋白(BSA)購自北京索萊寶科技有限公司(批號A8020);蛋白抽提試劑盒購自谷歌生物(批號G2002)；蛋白濃度試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所(批號P0006)等。

1.1.3 主要儀器 X-OMAT BT醫(yī)用X射線膠片(柯達(dá)XBT-1)，可見分光光度計(jì) (美譜達(dá)UV6100S)，純水儀(AJC-0501-P)，微型旋渦混合器(WH-2)，水浴鍋(TL-420D)，酶標(biāo)儀(RT-2100C)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 將40只昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、醋酸強(qiáng)的松組、海珠益肝加味方組,每組10只。各組小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)兩天后，除正常對照組外，其余組小鼠于實(shí)驗(yàn)第1天尾靜脈注射Con A 20mg/kg(生理鹽水稀釋,濃度為2mg/ml)。并于第1天開始灌胃給藥，醋酸強(qiáng)的松組以醋酸強(qiáng)的松7.8mg/kg灌胃、海珠益肝加味方組以海珠益肝加味方13.4ml/kg灌胃，正常組、模型組以蒸餾水0.2ml/10g灌胃,每天1次,連續(xù)3天。末次灌胃給藥后4h，模型組、醋酸強(qiáng)的松組、海珠益肝加味方組一次性尾靜脈注射Con A 20mg/kg[4]。8h后，摘眼球取血，室溫靜置2h，低溫離心留取血清。頸椎脫臼處死動(dòng)物摘取肝臟。取肝組織石蠟包埋切片做HE染色。肝組織標(biāo)本勻漿、離心留取上清。取適量肝組織凍存于液氮，2h后再轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱，以備作Western-blot檢測。

1.2.2 指標(biāo)檢測方法 按各試劑盒說明書的要求測定小鼠血清AST、ALT水平(采用賴氏法)及血清IL-4、IL-6的水平(采用ELISA法)。肝組織MDA、SOD指標(biāo)的測定分別采用硫代巴比妥酸比色法、黃嘌呤氧化酶法，肝組織NF-κB-p65表達(dá)水平的測定采用Western-blot法。

1.2.3 肝組織病理學(xué)觀察 取各組小鼠肝右葉條形組織塊(約0.2g)，用4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察各組肝組織的病理變化。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清中ALT、AST、IL-4、IL-6的水平 見表1。

2.2 各組小鼠肝組織SOD活性、MDA及NF-κB-p65水平 見表2。

表2 各組小鼠肝組織SOD活性、MDA及NF-κB-p65水平

與正常組比較，*P<0.05；與模型比較，##P<0.01，#P<0.05

2.3 各組小鼠肝組織病理變化 正常組在HE染色中肝細(xì)胞漿均勻紅染，細(xì)胞核大小正常，核質(zhì)淡染，肝竇清晰可見，肝索排列整齊。模型組肝組織內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤，胞質(zhì)疏松，線粒體腫脹，嵴模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，毛細(xì)膽管擴(kuò)張肝竇內(nèi)大量紅細(xì)胞淤積，肝板消失、凋亡小體散在、肝細(xì)胞脂肪變性。血管周圍的肝細(xì)胞胞漿疏松，染色變淺，肝竇間隙明顯增寬，有的還可見點(diǎn)狀壞死、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤。與模型組比較,醋酸強(qiáng)的松組和海珠益肝方加味組肝細(xì)胞腫脹明顯減輕，未見明顯毛細(xì)膽管擴(kuò)張，線粒體輕度腫脹、嵴存在，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴(kuò)張。

表1 各組小鼠血清ALT、AST、IL-4、IL-6的水平

與正常組比較，**P<0.01；與模型比較，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

Con A是一種植物凝集素，在體外激活T細(xì)胞的絲裂原，活化T淋巴細(xì)胞而致免疫性肝損傷。Imose[5]等報(bào)道靜脈注射BALB/c小鼠8～12h內(nèi)可引起明顯的肝損害,并證明損傷機(jī)制為CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的，與人類的病毒性肝炎發(fā)病機(jī)理十分相近。Con A誘導(dǎo)的肝損傷動(dòng)物模型是較為理想的免疫性肝損傷動(dòng)物模型。Con A導(dǎo)致肝損害的機(jī)制主要有:存在肝竇內(nèi)大量的巨噬細(xì)胞，激活后產(chǎn)生的細(xì)胞因子TNF-α可直接損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡、壞死[6];大量活化體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞與細(xì)胞因子IFN-γ等通過血流到達(dá)肝臟，直接或間接與肝細(xì)胞接觸后，激活巨噬細(xì)胞、破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致肝損傷[7]。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，是反映組織氧化損傷的指標(biāo)之一，可以間接反映體內(nèi)氧自由基的代謝狀況和機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，其生成量隨氧自由基生成的增加而增加。SOD是氧自由基的特異清除劑，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化損害。

肝損傷過程中特別是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)容易引起肝細(xì)胞內(nèi)氧自由基的大量產(chǎn)生,進(jìn)而這些氧自由基作始動(dòng)因子作用于細(xì)胞膜上的脂質(zhì),進(jìn)行脂質(zhì)過氧化的鏈所反應(yīng)。炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(TNF-α等)將導(dǎo)致肝細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷，在生理水平上體現(xiàn)為肝細(xì)胞抗氧化能力的下降和膜脂過氧化反應(yīng)的加劇，以及進(jìn)一步加重的膜損傷[8]。本實(shí)驗(yàn)表明,海珠益肝加味方能降低Con A誘導(dǎo)的肝損傷鼠血清中ALT、AST及肝組織中MDA的水平，提高SOD的活性，減輕肝組織的病理損傷，驗(yàn)證了其對免疫性肝損傷小鼠肝臟功能的防護(hù)作用。

IL-4是一種由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,以往稱為B細(xì)胞生長因子,同時(shí)也活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞,被認(rèn)為是典型的由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,對炎癥性細(xì)胞因子的釋放和這些細(xì)胞的殺菌活性有明顯抑制作用。IL-6為多效的細(xì)胞因子，生理功能復(fù)雜，既有促炎作用，又有抗凋亡作用。NF-κB是一組結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋自質(zhì)家族組成，由p65和p50構(gòu)成的異二聚體，屬Rel蛋白家族成員。NF-κB能與許多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因啟動(dòng)子區(qū)域的固定核有酸序列結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)方而發(fā)揮重要作用。p65位于胞質(zhì)中，在各種肝臟疾病(如免疫性肝損傷和肝癌等)發(fā)展過程中均處于激活狀態(tài)，對治療肝臟疾病具有明顯的作用[9]。有證據(jù)證明，具有NF-κB位點(diǎn)并受NF-κB調(diào)控的細(xì)胞因子基因有TNF-α、IL-2、IL-6 等[10]。抑制p65的表達(dá)被作為調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)的一個(gè)重要的指標(biāo)。

海珠益肝方由葉下珠、海藻、茯苓、白花蛇舌草、白芥子、莪術(shù)等六味藥組成，前期研究提示對免疫性肝損傷小鼠神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)作用[11]。海珠益肝加味方在海珠益肝方基礎(chǔ)上加用太子參、枸杞子組成，是盛國光教授治療CHB的經(jīng)驗(yàn)方，具有解毒、化痰、消瘀、補(bǔ)虛的功效[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較,海珠益肝方加味組NF-κB-p65的水平降低，IL-4、IL-6明顯上升，說明海珠益肝加味方能調(diào)控免疫反應(yīng)的NF-κB通路，更好抑制免疫反應(yīng)，預(yù)防、減輕免疫性肝損傷的肝臟炎癥，具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用。