棉種質量安全之真實性和純度SSR分子檢測研究進展

王 飛

（河南省農產品質量安全檢測中心，河南 鄭州 450000）

長久以來，棉種的純度與真實性鑒定停留在一些傳統方法上，如田間種植鑒定法，其需要投入大量的物力、人力，且時效性差，易受人為和環境的影響，制約了對棉種的質量管控。隨著分子生物學技術的發展，利用SSR分子檢測技術進行品種真偽與純度鑒定已成為發展趨勢，國際植物新品種權保護聯盟在分子測試指南中，將構建DNA指紋數據庫的標記方法確定為SSR[1]。

1 SSR分子標記原理

SSR（簡單重復序列，Simple Sequence Repeat）是由幾個核苷酸組成的短序列首尾連接重復多次構成，在作物DNA中串聯重復排列[2]。每個SSR側翼序列通常是同一作物品種中相對保守的單拷貝序列，由該序列可設計出一對互補寡聚核苷酸引物，再經過SSR-PCR擴增，其產物通過電泳檢測可顯示出不同品種間重復次數的差異。

2 研究進展

2.1 檢測體系的優化

SSR分子技術鑒定棉種的真實性和純度的一般步驟分為棉種DNA提取、PCR擴增、PAGE凝膠電泳及銀染。在棉種DNA提取方法上，宋國立等[3]提出了改良的CTAB法，該法能夠較好地去除DNA中的棉酚、單寧等物質。高文偉等[4]采用改良的SDS-CTAB法，不需要多次酚-氯仿抽提，得到了高質量的棉花DNA，是一種高效簡潔的DNA提取法。然而以上方法都是以棉花組織或葉片為試驗材料，不能滿足鑒定要求的時效性。匡猛等[5]開發了一種直接以棉籽為材料，只需兩次酚-氯仿-異戊醇抽提獲得棉種DNA的方法，其顯著提高了檢測的時效性。

在反應條件上，田海燕等[6]指出，DNA純度、退火溫度(Tm)、鎂離子濃度是影響擴增體系最關鍵的條件，而同一引物對于不同品種的退火溫度不同，且在退火溫度允許的范圍內，較高的Tm可有效降低模板與引物之間的非特異性結合，增強擴增反應的特異性[7]。經過大量試驗探索將擴增反應程序設置為：94℃預變性4 min，1個循環；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共32個循環；72℃延伸12 min，1個循環；4℃放置備用。

電泳檢測方法有3種，即瓊脂糖電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中，瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物分辨度最低，大小100～300 bp，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳次之，而變性聚丙烯酰胺凝膠分辨率最低，可達1 bp[8]。非變性膠操作簡單，但往往會檢測到雜合鏈，因此常檢測出假陽性譜帶；變性膠檢測出的是單鏈，沒有雜合鏈，條帶清晰，等位基因類型豐富，但是操作相對煩瑣[9]。對于品種差異性鑒定來說，存在較小差別的DNA擴增產物瓊脂糖凝膠電泳和非變性凝膠電泳較難分辨，只有變性膠凝膠電泳更適合品種差異性鑒定。鑒定材料從葉片發展到種子，適應了檢測過程時效性的要求；PCR反應參數和檢測平臺的優化使得鑒定結果更加真實可靠。總之，試驗體系的不斷改善，為棉種SSR分子檢測奠定了基礎。

2.2 核心引物的篩選及應用

核心引物篩選是棉種分子檢測技術中最基礎也是最關鍵的一步，其也是構建DNA標準指紋圖譜的前提條件。在主要農作物中，水稻和玉米制訂了DNA指紋方法的兩個行業標準（《NYT 1432—2007玉米品種鑒定DNA指紋方法》和《NYT 1433—2007水稻品種鑒定 DNA指紋方法》)，并得到了廣泛應用。然而棉花是常異花授粉異源四倍體作物[10]，自然混雜相對比較嚴重，其標準的制訂相較其他作物更為困難。匡猛等[11]以32份棉花主栽品種為材料，對214對SSR引物進行篩選，得到36對在染色體上分布均勻的核心引物，將差異位點大于或等于2個的樣品判定為雜株，并指出在品種鑒定上最少采用5對引物相組合即可將32個棉花品種完全區分開。付小瓊等[12]研究認為，當2個以上引物譜帶與其他樣品不一致時，則判定其為雜株，且田間性狀表現與SSR標記檢測結果有較高吻合度。王飛等[13]采用52對核心引物對7個棉花品種進行了SSR分析，初步將大于或等于3個差異位點的樣品判定為雜株，并對棉種中的非純位點現象進行了分析。

筆者認為，對于棉花雜株的SSR判定方法，要充分驗證田間鑒定與DNA分子檢測的結果，將待測樣品中雜株的差異位點閾值限定在更精確范圍內，以提高棉種純度分子檢測的準確性。而核心引物數量還需進一步探討，品種純度檢測可以說是一個鑒別不同品種的過程，因此應選擇能夠有效區分混雜種子的標記。

3 問題與展望

棉種真實性和品種純度鑒定是確保種子質量安全的重要手段之一。從棉種的遺傳物質特性上，即利用SSR的多態性能夠對品種間和同一品種內遺傳變異進行準確的分析。然而，在分子檢測真實性方法上還存在一些問題需要解決，例如真實性鑒定過程中差異位點閾值的問題，在《玉米品種真實性SSR鑒定技術規范》中規定：若待測品種和標準品種至少需要比較20個單株的特征帶型，若兩份樣品相同譜帶的單株比例達到20%以上，則該位點無差異為真實品種，反之為假品種。在棉種分子檢測標準制定中，可參考玉米的鑒定規范，再結合棉花自身特性，探索出適用于主栽棉花品種的差異位點判定方法。

棉種真實性和純度分子檢測技術的完善還需借鑒其他作物的成功經驗，不斷探索總結。總之，SSR檢測技術為棉花品種分子檢測方法開辟了一條全新路徑，為我國棉種質量安全提供了可靠的技術保障。