核酸熒光探針在單細胞成像中的應用研究

賈永梅 婁筱叮 夏 帆*,3

1(嶺南師范學院化學化工學院， 湛江 524048) 2(中國地質大學(武漢)材料與化學學院， 武漢 430074)3(華中科技大學化學與化工學院， 武漢 430074)

1 引 言

細胞是生命的基本單位，其中包含各種生物活性物質，如核酸(DNA、RNA)、蛋白質、離子、生物小分子等。對這些生物活性物質進行準確、實時、原位監測，可詳細闡述它們在生命過程中的作用、引發的生物學效應及生物學功能，對生命科學研究、重大疾病診斷和個性化治療具有重要意義[1]。在對這些生物活性物質進行研究的眾多方法技術中，細胞成像研究技術由于具有觀測定位精準的特點、獨特的時間和空間分辨率高的性質，成為分子水平上準確、實時、原位監測細胞內生物活性物質信號變化及觀測細胞形態的重要手段[2]。

在進行單細胞成像研究時，細胞內大多數生物活性物質自身無法產生易被儀器或肉眼所捕獲的信號，通常需使用生物探針進入細胞內特異性識別生物活性物質，并與特定的生物活性物質結合，形成穩定的復合物，產生相應信號變化，通過監測生物探針信號變化，實現對細胞內生物活性物質準確、實時、原位監測[3]。生物探針的響應信號有多種，其中熒光信號在用于單細胞成像研究時，具有直觀[4]、操作簡單[5]、選擇性好[6]、靈敏度高[7]、無需參比、不受電磁場的影響、可遠程實時在線自動監測等特性[8]，還具備對細胞進行靜態觀察、對細胞內分子動力學進行動態監測、對亞細胞結構進行定位和對蛋白質分子的相互作用進行研究等優點[9]，在單細胞成像技術研究中發揮了重要作用。

近年來，研究者設計并合成出一系列熒光探針，如核酸熒光探針[10]、多肽熒光探針[11]、納米熒光探針[12]等，利用熒光探針與目標分子之間的特異性識別作用，成功地將其引入到單細胞成像研究中，使得該研究領域進入一個全新階段。本文重點介紹近五年來核酸熒光探針在單細胞成像中的研究進展。

2 核酸熒光探針應用于細胞成像

2.1 雙標記核酸熒光探針

自1996年Tyagi等[13]首次提出分子信標(MB)探針以來，由于其相比DNA線性探針具有較高的特異性、價格低廉、設計及合成簡單等優點，在生物傳感器中被廣泛應用。通常MB探針在設計和應用時，需標記熒光基團和淬滅基團。無目標分子存在時，MB探針自身形成特定的空間結構，熒光基團和淬滅基團在空間上靠近，所以MB探針自身不發射熒光; 當目標分子存在時，它和MB探針的環狀部分結合，打開MB探針，使得熒光基團遠離淬滅基團，因此發射出熒光信號[14]。通過監測探針熒光信號變化，實現對目標分子檢測(圖1)。

圖1 分子信標熒光探針在細胞成像中的應用：(A) 分子信標探針識別DNA分子檢測原理[15]; (B) 基于Bst聚合酶誘導的鏈置換反應和核酸外切酶輔助的循環反應的二次酶放大策略檢測miRNA[16]; (C) DNA四面體結構探針在細胞內攝取與轉運過程[19]; (D) 利用雙色DNA四面體納米結構檢測細胞內miRNA-21和miRNA-155[21]。Fig.1 Molecular beacons (MB) used for intracellular imaging: (A) Schematic representation of recognition mechanism for random DNA[15]; (B) Schematic illustration of HQEA strategy for miRNA detection based on Bst polymerase induced strand displacement reaction and a lambda exonuclease-aided recycling reaction[16]; (C) Schematic of cellular uptake, transport and fate of DNA tetrahedral[19]; (D) Dual-color DNA TetrNano for simultaneous detection of intracellular miRNA-21 and miRNA-155[21]

細胞膜帶有大量負電荷，通常會將同樣帶有負電荷的核酸分子屏蔽在膜外，而MB探針是帶負電荷的親水性大分子化合物，因此不能自由地穿過細胞膜的磷脂層。Qiu等[15]利用可細胞內化的核酸適配體和MB探針的雜交結構，開發了一種自輸送、光激活的分子信標MB探針，用于實時檢測活細胞內miRNA (圖1A)。利用標記Cy5熒光基團的核酸適配體AS1411作為載體探針，MB探針可以被高效地輸送到指定細胞的細胞質，而其細胞內化的量及其在細胞內的分布均可依據光照射前后Cy5的熒光共振能量轉移(FRET)信號變化進行實時跟蹤。利用切割反應，有效控制MB探針的檢測行為，實現在單細胞體系中檢測目標RNA，時空分辨率高。

雖然MB探針非常適合在均質及活細胞體系中檢測目標分子，但是MB探針和靶分子DNA以1∶1的比例結合，利用堿基配對作用力對目標分子進行檢測，通常檢測靈敏度低。為了克服這一技術難題，Duan等[16]設計了一種一步法、超靈敏的二次循環擴增檢測方法用于MCF-7細胞系中miR-21和PC3細胞系中miR-221的檢測。利用缺刻內切酶、DNA聚合酶和消化酶以及一條改進的分子信標探針，設計了一個雙循環反應，實現了靶標分子和信號探針的比例為1∶N2的超靈敏反應策略，通過檢測miR-21在乳腺癌組織和正常組織中的表達量，表明該方法可以很好地區分乳腺癌組織及正常組織(圖1B)。

傳統的DNA探針常用一維(單鏈DNA)或二維結構(如發夾結構)作為識別元件，其傳感界面的均一性在制備過程中難以得到有效控制，影響實際應用中檢測的穩定性和重復性。而三維結構的DNA探針具有高結構穩定性和剛性，可以有效提高DNA探針在表面分布排列的均一性，并精確調控探針之間的距離，顯著提高對目標分子檢測的靈敏度和特異性。自2011年Li等[17]首次利用DNA四面體作為一種納米尺度的藥物載體，將具有免疫刺激效應的CpG寡核苷酸轉運進入細胞并刺激產生特定的細胞因子以來，DNA四面體結構在生物傳感領域引起廣泛關注。傳統的單細胞成像技術利用共聚焦熒光顯微鏡進行表征，而超分辨率熒光顯微鏡可打破原有的光學遠場衍射極限對光學系統極限分辨率的限制，很容易超過光學分辨率的極限，達到納米級分辨率[18]。該課題組利用超分辨率熒光顯微鏡技術的這一優點，結合生物化學手段，清晰地展示了一類自組裝DNA四面體結構在活細胞中的攝取與轉運過程(圖1C)，并實現在活細胞體系中觀察端粒酶的準確位置[19,20]。Zhou等[21]將DNA四面體結構和MB探針的優點結合起來，在DNA四面體結構的兩條DNA鏈中分別標記對不同目標分子具有識別功能的MB探針，并標記不同熒光基團，通過監測不同發射波段的熒光信號變化，實現在單細胞體系中對miRNA-155和miRNA-21的檢測(圖1D)。而He等[22]利用兩個DNA四面體結構之間的鏈置換反應，催化放大信號， 實現在單細胞體系中檢測miRNA。

2.2 單標記核酸熒光探針

2.2.1基于FRET原理檢測的單標記核酸熒光探針為了降低熒光探針的設計難度、設計成本并拓寬其應用范圍，研究者們利用一些功能納米材料的獨特性質，構建單標記熒光探針[23]，基于熒光共振能量轉移(FRET)原理，實現對目標分子檢測(圖2)。

圖2 (A) 利用適配體/氧化石墨烯的納米復合物用于活細胞內分子及體外分子的原位探測過程[26]; (B)在二元體系中檢測單細胞內miRNA[30]; (C) 利用AIE熒光探針原位監測細胞內端粒酶活性[34]; (D) 利用雙熒光信號探針檢測細胞內及細胞提取物中的端粒酶活性[36]Fig.2 (A) Schematic illustration of in vitro and in situ molecular probing in living cells by using aptamer/GO-nS nano complex[26]; (B) Schematic illustration of the binary system for miRNA tracking in the single cells[30]; (C) Schematic illustration of the aggregation-induced emission (AIE)-based in situ telomerase activity detection and imaging[34]; (D) Schematic illustration of double fluorescent signal bioprobe for detection of extracellular and intracellular telomerase activity[36]

基于FRET原理的檢測中包括能量受體和能量給體兩個部分。在能量受體方面，自2004年Novoselov等[24]發現石墨烯以來，石墨烯由于其獨特的結構以及優異的電學、光學、力學和熱學等性能，在催化、能源、防腐、電子器件和化學及生物傳感等領域有著廣泛的應用前景。其中氧化石墨烯由于其良好的分散性、水溶性以及生物相容性而在生物化學傳感領域得到了較好的發展。作為一種二維碳納米材料，石墨烯具有較大的比表面積和較強的熒光淬滅能力，可作為一種有效的生物載體將生物分子運輸到細胞內部[25]。基于以上原理，Wang等[26]將標記有FAM熒光基團的核酸適配體和氧化石墨烯(GO)結合，構建納米復合物，利用細胞的胞吞作用進入細胞內部。核酸適配體結合細胞質中的ATP而脫離GO表面，此時熒光基團FAM遠離淬滅基團GO，因此發射熒光，利用激光共聚焦顯微鏡成像技術實現對細胞質中ATP的可視化成像分析(圖2A)。Xing等[27]利用GO能強烈吸附熒光標記的單鏈DNA(ssDNA)并淬滅其熒光的能力，將GO引入單標記核酸熒光探針檢測體系，實現對核酸序列、離子、蛋白質及小分子等目標分子的檢測。

除GO外，還有一種功能納米材料-納米金在細胞成像中也被廣泛應用。納米金在可見光區有很強的吸收，且生物相容性好，表面易于功能化修飾，是優良的能量受體，同時還可以通過增強熒光分子吸收以及輻射衰減等途徑增強熒光發射[28]。Qian等[29]設計一種基于帶缺口MB探針構建而成的功能化納米探針，用于原位檢測單細胞內端粒酶活性。MB探針標記有端粒酶引物(TSP)，有端粒酶時，端粒酶可引發TSP以重復片段擴增，導致內部鏈取代和雜交并打開MB探針的發卡結構，此時端粒酶被“點亮”，通過動態監測端粒酶活性在不同劑量與端粒酶活性相關藥物作用下的變化，實現在單細胞體系內原位定量檢測端粒酶活性并區分腫瘤細胞與正常細胞。該研究方法為端粒酶活性相關的生物學研究、腫瘤的臨床診斷和治療提供了潛在工具。Qian等[30]以納米金為能量受體，熒光基團Cy5作為能量給體，將不同DNA序列的MB1探針和MB2探針分別標記在納米金上。分子信標(MB1和MB2)探針的熒光基團和淬滅基團非常臨近，所以分子信標(MB1和MB2)探針自身不發射熒光。 miRNA存在時，它和分子信標探針的環狀部分結合，打開分子信標(MB1和MB2)探針，使得熒光基團和淬滅基團遠離，因此發射熒光。通過監測熒光信號變化，實現在單細胞體系中對miRNA檢測，同時納米金聚集，其最大吸收峰向近紅外波段移動，更有利于光熱治療，殺死癌細胞(圖2B)。Pan等[31]將標記有Alexa Fluor 488的MB1探針和標記有Cy3的MB2探針同時標記在納米金上，此時分子信標(MB1和MB2)探針的熒光基團和淬滅基團非常臨近，因此分子信標(MB1和MB2)探針不發射熒光。當有Survivn RNA存在時，它和MB1探針的環狀部分結合，打開MB1探針，使得熒光基團Alexa Fluor 488遠離淬滅基團，因此Alexa Fluor 488發射熒光。當TK1Mrna存在時，它和MB2探針的環狀部分結合，打開MB2探針，使得熒光基團Cy3遠離淬滅基團，且此時熒光基團Alexa Fluor 488和熒光基團Cy3的距離較近，可有效發生FRET現象，通過監測FRET信號變化，實現在單細胞體系中檢測多重mRNA。

在能量給體方面，隨著新材料技術的發展，也取得了一些新的突破。傳統的熒光染料在高濃度時或聚集狀態下，熒光淬滅，即聚集誘導淬滅(ACQ)現象。2001年Tang等[32]發現一類分子在溶液中幾乎不發光，而在聚集狀態或固態會發出很強的熒光，即聚集誘導發光(AIE)現象，大大拓寬了熒光探針在生化傳感領域中的應用范圍。與傳統的熒光探針相比，AIE探針具有優越的抗漂白能力和更高的可靠性[33]。基于AIE分子的獨特發光效應，Zhuang等[34]在端粒酶引物5’端標記淬滅基團，無端粒酶時，引物無法擴增，帶有正電荷的AIE分子與核酸分子通過靜電作用力結合，形成穩定的復合物，此時AIE分子聚集狀態弱，且AIE分子與淬滅基團非常臨近，AIE分子的熒光被淬滅; 有端粒酶時，引物以重復片段擴增[35]，擴增片段會繼續與AIE分子通過靜電作用力結合，形成穩定的復合物，此時AIE分子以聚集狀態存在，且遠離淬滅基團，因此AIE分子發射熒光。通過監測AIE分子熒光信號變化，實現在單細胞體系中檢測端粒酶活性(圖2C)。在單細胞成像時，該研究方法大大降低了背景熒光信號干擾，增加了檢測方法的可靠性。同時，該課題組[36]在端粒酶引物標記淬滅基團可降低背景熒光信號干擾的基礎上，還利用最大發射波長為藍光波段的AIE分子和紅光波段的AIE分子彼此之間可產生FRET現象，實現在單細胞體系中檢測端粒酶活性，大大拓寬檢測范圍(圖2D)。

2.2.2基于親疏水作用力檢測的單標記核酸熒光探針傳統核酸熒光探針在設計和應用時，需要標記熒光基團和輔助基團(淬滅基團或能量匹配基團)，另外還需考慮熒光基團的標記位置(末端或內部修飾)，增加熒光探針的設計難度及應用成本、降低對生物活性物質檢測靈敏度和特異性。利用傳統核酸熒光探針進行單細胞成像研究時，需反復洗滌，除去未與目標分子結合的熒光探針，以降低背景信號。該方法操作步驟繁瑣，限制了其實際應用。近年來，研究者在開發新型熒光探針時，越來越關注物質的本源特性[37]，如吸光性、親疏水性等物理化學性質，其中親疏水作用力作為生命活動兩大作用力之一，具有響應迅速、特異性識別目標分子能力強、無需額外引入輔助物質等特性，引起研究者關注 (圖3)。

圖3 (A) 基于端粒酶引物延長和Exo Ⅲ輔助的二次放大策略示意圖[40]; (B) 基于DSN酶的催化放大策略和利用AIE功能核酸分子探針檢測單細胞體系中汞離子[41]; (C) 利用復合探針CF-DNA的親疏水可調控性能，檢測細胞內端粒酶活性[42]; (D) 基于共軛聚合物的熒光探針CP-DNA，應用于端粒酶活性檢測中[43]Fig.3 (A) Schematic illustration of quadratic amplification strategy based on telomerase elongation reaction and Exo Ⅲ-aided reaction[40]; (B) Schematic illustration of DSN enzyme based catalytic amplification analysis of Hg2+ ions in living cells using AIEgens functional nucleic acids probe[41]; (C) Conjugated fluorene-DNA composite probe (CF-DNA) for sensitive detection of telomerase activity in living cells by turning the hydropathical profile of bipolar probes[42]; (D) Conjugated polymers-DNA for sensitive detection of telomerase activity in living cells[43]

Min等[38]利用TPE分子的聚集誘導發光特性，及核酸DNA分子在蛋白酶的作用下的結構可精確調控性能，對TPE分子進行特殊修飾。通過Click反應，將TPE分子與DNA分子共價鍵結合，構建具有親疏水可調控性能的單標記核酸熒光探針TPE-DNA。miRNA存在時，miRNA與核酸熒光探針TPE-DNA通過堿基互補配對作用，形成雙鏈結構，利用核酸外切酶Ⅲ識別DNA雙鏈結構的3’凹陷端并將其降解的特性，實現對miRNA的循環檢測，進一步調節反應溫度，可將檢測限降低到10 amol/L。但是TPE分子在紫外光照射下，發射藍色熒光，在進行單細胞成像研究時，易受生物自體熒光信號干擾。該課題組繼而對TPE分子進行特殊修飾，使其在紫外光照射下發射黃色熒光，并將其與DNA共價鍵結合，形成具有親疏水性可調控的單標記核酸熒光探針TPEPy-DNA，并利用該探針監測活細胞內miRNA[39]和端粒酶活性[40](圖3A)。與傳統的單標記核酸熒光探針相比，該探針在進行單細胞成像研究時，具有很好的光穩定性。此外，該課題組[41]還將TPE衍生物與DNA共價鍵結合，構建具有親疏水可調控性能的單標記核酸熒光探針AFNAs，Hg2+可特異性識別堿基T，并形成穩定的復合物，通過調控單標記熒光探針AFNAs的聚集狀態，實現在單細胞體系內檢測Hg2+(圖3B)。

Xia課題組根據生物活性物質調控單標記核酸熒光探針的親疏水性質及聚集狀態能力不同，利用共軛聚合物穩定的光電性質及光學信號倍增特性，開發出兩種基于共軛芴分子的單標記核酸熒光探針。一種是基于分子量為700共軛芴的單標記核酸熒光探針 (圖3C)[42]; 另一種為基于分子量>5000共軛聚合芴的單標記核酸熒光探針 (圖3D)[43]。利用這兩種具有親疏水可調控性質的單標記核酸熒光探針所構建的生物/化學傳感器，僅靠調控探針的親疏水性，引起疏水基團“聚集”和“分散”兩種狀態變化，即可產生相應熒光信號變化，通過監測熒光信號變化，實現在緩沖溶液體系、復雜樣本體系中對核酸(DNA、RNA)序列、蛋白質、離子及生物小分子等目標分子的高靈敏、高特異性、高效檢測。另外將該探針引入到活細胞體系中，實現了在單細胞體系中端粒酶活性檢測。

2.3 基于靜電作用力檢測的免標記核酸熒光探針

免標記熒光分析法，由于無需對探針進行標記，探針的設計與合成較簡單，合成與純化周期短。Qian等[44]以多孔硅納米粒子(MSN)為載體，在MSN孔道內共價固定熒光淬滅劑BHQ和填充熒光素，通過靜電吸附在其表面包裹含有端粒酶底物片段的DNA鏈，將熒光素封堵在孔道內。在端粒酶的作用下，端粒酶引物擴增，導致探針擴增產物的兩端雜交形成環狀結構而脫離MSN表面，從而打開孔道，釋放熒光素，此時熒光素遠離淬滅劑BHQ，因此發射熒光。通過檢測熒光信號變化，實現在細胞內檢測端粒酶活性(圖4A)。

共軛聚合物由于具有獨特的分子線效應、強光捕獲以及信號放大的特性，引起研究者們關注[45]。但共軛聚合物為疏水材料，而生物分子通常需在均相水溶液體系中才可保持其生物活性。為將共軛聚合物引入熒光探針檢測傳感體系，Lv等[46]對共軛聚合物的支鏈進行特殊修飾，合成出水溶性共軛聚合物。同時利用水溶性共軛聚合物與生物活性分子間的靜電作用力，實現在均相水溶液體系中對目標分子檢測[47]，并成功將該功能納米材料引入活細胞中，實現在細胞內對目標分子準確、實時、原位監測[48](圖4B)。但傳統的水溶性共軛聚合物在對細胞內目標分子進行檢測時，多使用近紫外或白光光源。每種光的組織穿透性與其波長密切相關，波長越短，組織穿透性越弱，而近紫外及白光的波長范圍為200～780 nm， 表明組織穿透能力有限，當深層組織感染細菌的時候，近紫外及白光作光源的光動力療法將無能為力。Li等[49]將水溶性共軛聚合物與上轉換納米材料結合起來，以980 nm的近紅外光作為激發光源，激發上轉換納米材料，繼而通過FRET原理激發水溶性共軛聚合物，利用水溶性共軛聚合物產生的單線態氧或活性氧物質達到殺菌目的。

圖4 (A) 免標記熒光分析法檢測細胞內端粒酶活性[44]; (B) 在近紅外光下，利用共軛聚合物微球作為光熱轉換器，監測活細胞內基因表達狀況[48]; (C) 基于AIE分子的免標記法檢測細胞提取物中端粒酶活性[50]; (D) 基于氧化石墨烯平臺免標記的分子信標探針檢測端粒酶活性[51]。Fig.4 (A) Label-free fluorescence assay used for detection of intracellular telomerase activity[44]; (B) strategy to remotely control the gene expression in living cells with CPNs-Tat as photothermal transducer under NIR light[48]; (C) label-free fluorescence assay for telomerase activity [50]; (D) schematic illustration of GO-based platform for telomerase activity detection using label-free beacon[51]

免標記熒光分析法中所用的熒光分子有很多種，其中AIE分子由于其獨特的發光體系已經成為了一種強有力的分析工具，被廣泛應用于設計高靈敏度和高選擇性的“turn-on”型生物熒光探針和生物化學傳感器。利用AIE分子的獨特發光效應，核酸探針不再需要標記淬滅基團或者輔助基團，一條簡單的免標記核酸探針即可高效地完成對目標物的檢測，極大地簡化了傳統核酸探針的結構，降低探針的設計、合成成本及操作難度。基于靜電吸引力，Lou等[50]設計了一種基于AIE效應的免標記核酸探針，用于檢測單細胞體系和病人組織樣本中端粒酶活性。無端粒酶時，端粒酶引物帶有大量負電荷與帶有正電荷的AIE分子通過靜電作用力，形成復合物，此時AIE分子以分散態存在，熒光較弱; 有端粒酶時，端粒酶引物以重復片段擴增，擴增后產物可與大量AIE分子結合，形成復合物，此時AIE分子以聚集狀態存在，熒光增強。通過監測AIE分子熒光信號的變化，實現對單細胞體系和病人組織樣本中的端粒酶活性檢測(圖4C)。但是傳統的AIE分子，如TPE-Z在紫外光的照射下，呈藍色熒光，而生物材料的自體熒光也為藍色，在進行單細胞成像研究時，檢測信號易受背景信號干擾，產生假陽性結果。為了降低背景信號干擾，該課題組[51]利用GO吸附單鏈DNA、解吸附雙鏈DNA的功能，設計一條MB探針，其環狀部分可與端粒酶引物擴增片段互補配對。無端粒酶時，MB探針與AIE分子通過靜電作用力結合并形成復合物，由于其環狀部分為單鏈DNA，被吸附在GO表面，此時熒光基團AIE分子與GO距離較近，AIE分子的熒光被GO淬滅，因此不發射熒光; 有端粒酶時，端粒酶引物擴增，擴增片段與MB的環狀部分通過堿基互補配對作用結合并形成復合物，打開MB探針，并從GO表面解吸附，此狀態下，熒光基團AIE分子與GO遠離，因此發射熒光。通過監測AIE分子熒光信號變化，實現對病人組織樣本中端粒酶活性檢測。該方法降低背景熒光信號干擾，提高檢測信噪比，大大拓寬癌細胞端粒酶提取物檢測的線性范圍(圖4D)。該課題組[52]還利用調控DNA鏈的長短調控AIE分子的聚集狀態并產生相應熒光信號響應的特性，將線性腫瘤抑制基因p53片段通過連接酶的作用連接成環狀DNA，一旦這些環狀的p53片段被紫外輻射損傷，滾環擴增反應將不能順利進行，熒光信號急劇下降，最終實現光損傷的超靈敏檢測。該課題組[53]還將AIE分子應用于固體表面檢測目標分子，通過調控芯片表面的親疏水性，實現在固體芯片表面對miRNA高靈敏檢測。

3 結 論

熒光分析法具有靈敏度高、無需參比、不受電磁場影響等優點，被廣泛應用于細胞成像研究中。目前，新型核酸熒光探針應用于單細胞實時動態成像研究已取得顯著成果，但也存在一些問題需，要進一步探索：(1)核酸熒光探針的穩定性及安全性。傳統核酸熒光探針，尤其是有機熒光探針，在進行單細胞成像研究時，不穩定、易被漂白、生物毒性大。隨著納米材料的不斷發展，功能核酸熒光探針取得了較好的發展，但仍需進一步改進，合成具有更好的生物相容性、更長的體內循環時間、更低的毒性、易代謝的熒光探針，以使核酸熒光探針更好地應用于單細胞成像研究及活體實時動態示蹤和臨床醫學診斷及治療。(2)近紅外核酸熒光探針的制備。雖然在可見光條件下的核酸熒光探針應用于單細胞成像已經得到了一些滿意的結果，但由于生物材料對可見光的強烈吸收和散射，使得單細胞成像尤其在活體示蹤成像的深度僅局限在10-2m內，更深組織的成像還依賴于近紅外熒光探針的發展。