富G寡聚核苷酸修飾的金納米粒子與細胞相互作用的研究

孫艷紅 魏 佳 王振新 孟憲瑛*

1(吉林大學白求恩第一臨床醫院甲狀腺外科， 長春 130021)2(中國科學院長春應用化學研究所 電分析化學國家重點實驗室， 長春 130022)

1 引 言

金納米粒子(GNPs)具有合成簡單、形貌易于控制、易修飾并具有較強的表面等離子體共振(SPR)光吸收等特點，自1996年，Mirkin等將單鏈寡聚核苷酸(ssDNAs)修飾的GNPs應用于比色分析以來，ssDNAs與GNPs復合物(ssDNA-GNPs)作為納米探針或納米藥物載體在生物分析和生物醫學領域得到了廣泛應用[1～14]。以ssDNA-GNPs為探針的分析方法通常具有靈敏度高和選擇性好的特點。例如，與有機染料標記的熒光法相比，GNPs為探針的比色法對目標ssDNA的檢測限能夠降低2個數量級以上，并具有較寬的線性范圍，能夠實現復雜樣品中低豐度目標ssDNA的檢測[4,6]。另外，由于GNPs被認為是最穩定的生物相容性材料之一，從而使基于GNPs的診斷與治療相結合的納米復合物逐漸成為一類有良好臨床應用前景的納米藥物。已有研究表明，ssDNA-GNPs能夠逃避細胞的免疫反應進入到細胞內部，實現細胞內物質高靈敏檢測以及基因調控[12,14]。

ssDNA-GNPs的生物化學性質(DNA雜交、分子識別等)與所修飾的ssDNA的二級結構密切相關，ssDNA的表面密度、二級結構等均能夠影響其反應活性[13,15]。G四鏈體(G-quadruplex，G4)是由富含串聯重復鳥嘌呤(G)的DNA或RNA折疊形成的核酸二級結構，因其具有調控基因表達的生物學功能，被認為是一種潛在的腫瘤治療藥物或靶點。相對于線性ssDNA，具有G四鏈體二級結構的ssDNA能夠被細胞表面的A類清道夫受體(SR-A)識別，并由脂筏/小窩介導進入細胞，極大地增加ssDNA-GNPs復合物的細胞內吞量[15]。另外，研究表明，細胞對ssDNA-GNPs的吞噬量與ssDNA的序列有關，即細胞對富含堿基G的ssDNA-GNPs的吞噬量高于富含堿基A、T、C的ssDNA-GNPs[16]。據此，研究不同序列富含G堿基的 ssDNA修飾的GNPs與細胞相互作用的差異，對構建高效的基于ssDNA-GNPs的納米探針或基因載體有積極意義。目前，富G堿基ssDNA修飾的GNPs與細胞相互作用行為尚不清楚。本研究合成了兩種富G 的ssDNA-GNPs(PolyG1-GNPs和PolyG2-GNPs)，系統地考察了ssDNA的二級結構對ssDNA-GNPs的細胞毒性、細胞吞噬行為及其細胞內分布等的影響。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UVmini-1240紫外可見吸收光譜(日本島津公司); ELAN 9000/DRC電感耦合等離子體質譜(ICP-MS，美國Thermo Fisher Scientific公司); HITACHI H-600型透射電子顯微鏡(TEM，日本Hitachi公司)，5415R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司); Nano-ZS粒度儀(英國Malvern公司); HPC-250CL 恒溫恒濕箱(上海申賢恒溫設備廠); ZLS-1真空離心濃縮儀(湘儀離心機有限公司); Power Wave XS2型微孔板分光光度計(美國BioTek儀器有限公司)，Thermo Forma 371型恒溫恒濕二氧化碳細胞培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

氯金酸(HAuCl3·3H2O，阿拉丁公司); 二水合檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O，北京華騰化工有限公司); 青霉素和鏈霉素混合液、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、達爾伯改良伊格爾培養基(DMEM)、二甲基亞砜(DMSO)以及3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)均購于北京鼎國生物技術公司; 根據文獻[16]報道設計的二硫鍵修飾ssDNAs(PolyT: 5′TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-C6H12S-SC6H133; PolyG1: 5′GGT GGT GGT GGT CCT CCT CCC GGT GGT GGG AGG AGG TTT TTT-C6H12S-SC6H133; PolyG2: 5′GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT GGT TTT TTT-C6H12S-SC6H133)由上海生工生物工程股份有限公司合成; HeLa(人宮頸癌細胞)細胞株購自中國科學院上海細胞庫; 其它化合物均為分析純，購于北京化工廠。實驗用水為Milli-Q(美國Millipore公司)制備的超純水(18.2 MΩ cm)。

2.2 ssDNA-GNPs的合成

2.3 ssDNA-GNPs的細胞毒性和吞噬實驗

向DMEM中添加10% (V/V)FBS、1%(m/V)青霉素和1 %(m/V)鏈霉素配制完全培養基(CM)。將100 μL CM和8000個HeLa細胞加入96孔板的孔中，在二氧化碳培養箱(37 ℃，5% CO2)中培養24 h。 用100 μL PBS清洗后，分別加入含不同濃度(5、25和50 μg/mL)ssDNA-GNPs的100 μL CM， 繼續培養24 h。 用100 μL PBS清洗后，加入90 μL DMEM和10 μL 5 mg/mL MTT。孵育4 h后，加入100 μL DMSO，輕輕振蕩，使紫色結晶完全溶解，然后使用酶標儀在490 nm波長下進行吸光度檢測。以相同條件下正常培養的細胞為對照組，計算與ssDNA-GNPs作用后細胞的相對活率。

將1.3×105個HeLa細胞于12孔板內孵育24 h 后， 將細胞和25 μg/mL ssDNA-GNPs在不同條件下(CM中37℃、CM中4℃、DMEM中37℃或DMEM中4℃)孵育12 h。用100 μL PBS清洗3次后，使用胰蛋白酶將細胞消化并使用血細胞計數器來對細胞進行計數。加入1 mL 王水孵育24 h, 使用ICP-MS檢測細胞中Au的含量。同樣條件下，HeLa細胞與ssDNA-GNPs作用后，使用1 mL 多聚甲醛固定胰蛋白酶消化的細胞制備細胞切片，用于TEM觀察。同樣條件下，HeLa細胞與ssDNA-GNPs作用后，使用超聲波細胞粉碎儀(4 min，超聲30 s，間隔40 s)將胰蛋白酶消化的細胞打碎，加入100 μL PBS，混勻，轉移到96孔板內，使用酶標儀記錄其紫外-可見吸收光譜。

圖1 PolyG1和PolyG2在PBS中的圓二色譜，PolyG1和PolyG2的濃度為17 μmol/LFig.1 Circular dichroism (CD) spectra of PolyG1 and PolyG2 in PBS. The concentrations of PolyG1 and PolyG2 are 17 μmol/L respectively

3 結果與討論

3.1 ssDNA-GNPs的合成與表征

PolyG1和PolyG2在PBS中的圓二色譜(CD)如圖1所示，PolyG1在238 nm處有一個負的CD吸收峰，PolyG2在260 和240 nm 處有一對對稱的CD吸收峰。在此反應條件下，PolyG1為線性結構，而PolyG2能夠形成G四鏈體二級結構[19,20]。如圖2所示，所制備的檸檬酸鈉保護的GNPs具有較好的分散性，平均粒徑為(13±1) nm，水合粒徑為(13.4±2.4) nm， 最大SPR吸收峰位于519 nm處，與文獻[4,6]報道的結果一致。PolyT因與GNPs具有較高的反應活性，通常在制備ssDNA-GNPs過程中被用作穩定劑。分別使用不同摩爾比的PolyT∶PolyG1或PolyT∶PolyG2與GNPs反應制備ssDNA-GNPs。結果表明，ssDNA-GNPs在PBS中的膠體穩定性隨ssDNA混合物中PolyT的比例增加而增強。當ssDNA混合物中PolyT摩爾比低于20%時，所合成的ssDNA-GNPs在PBS中易發生聚集。此現象可能是由于PolyG1或PolyG2與GNPs的反應效率低，使其表面存在一定量的活性位點，并與PBS中Na+產生靜電作用導致的。綜合考慮ssDNA-GNPs的膠體穩定性以及與細胞的反應活性，在后續的實驗中使用摩爾比為1∶4的PolyT∶PolyG1或PolyT∶PolyG2與GNPs反應制備ssDNA-GNPs。如圖2和表1所示，TEM、紫外可見吸收光譜、水合粒徑分析表明，制備的ssDNA-GNPs在不同的分散介質中均能夠保持良好的分散性。ssDNA修飾后，GNPs的最大SPR吸收峰發生紅移，水合粒徑增大，與文獻[1～3,21]報道的結果一致。另外，由于ssDNA-GNPs與完全培養基(CM)中的蛋白質相互作用，蛋白質吸附在ssDNA-GNPs表面， 使其水合粒徑和表面荷電量進一步增大。

圖2 (A)檸檬酸根保護的GNPs、 (B)PolyG1-GNPs和(C)PolyG2-GNPs的TEM圖; (D) 0.32 nmol/L GNPs的紫外-可見吸收光譜Fig.2 Transmission electron microscopy (TEM) images of (A) citrate-capped gold nanoparticles (GNPs), (B) PolyG1-GNPs and (C) PolyG2-GNPs; (D) Corresponding UV-vis absorption spectra, the concentrations of three GNPs are all 0.32 nmol/L

表1 ssDNA-GNPs在不同介質中的最大SPR吸收峰、水合粒徑和Zeta電勢

Table 1 Maximum SPR absorption bands, hydrodynamic sizes and Zeta potentials of as-prepared ssDNA-GNPs

3.2 細胞對ssDNA-GNPs的吞噬機制

ssDNA-GNPs具有與所修飾ssDNA類似的生理功能，無需陽離子或親脂性轉染試劑即可進入細胞內部，因此被認為是一類具有良好應用前景的納米藥物[22]。早期已有研究報道ssDNA的堿基種類能夠影響ssDNA-GNPs與細胞的作用方式[16]，但未具體研究ssDNA的構型對ssDNA-GNPs與細胞相互作用的影響。使用ICP-MS測定了不同條件下與ssDNA-GNPs共培養后，HeLa細胞中GNPs的含量。如圖3A所示，在正常培養條件(37℃下CM中)下，單個HeLa細胞中的PolyG1-GNPs和PolyG2-GNPs含量分別為4.7105和6.4105個，表明二者均與HeLa細胞有較強的相互作用。HeLa細胞對PolyG2-GNPs的吞噬量大于文獻[16]報道的SR-A高表達的C166細胞對富G堿基ssDNA修飾的GNPs的吞噬量(5105個/細胞)。另外，在所有實驗條件下，HeLa細胞對PolyG2-GNPs的吞噬量均大于其對PolyG1-GNPs吞噬量，這表明具有G四鏈體二級結構的PolyG2能夠通過與細胞表面受體(如A-SR等)的相互作用增加細胞對PolyG2-GNPs的內吞。相同培養溫度下，在DMEM中培養的HeLa細胞對ssDNA-GNPs的吞噬量約為正常培養的HeLa細胞對ssDNA-GNPs吞噬量的16倍。相同的培養基中，在4℃下培養的HeLa細胞對ssDNA-GNPs的吞噬量小于在37℃下的HeLa細胞; 其中正常培養的HeLa細胞對ssDNA-GNPs的吞噬量下降了約50%，在DMEM中培養的HeLa細胞對ssDNA-GNPs的吞噬量下降了約75%。這表明細胞對ssDNA-GNPs的內吞與能量有關，即處于正常生理溫度(37℃)和饑餓狀態下(無FBS)的HeLa對ssDNA-GNPs有較大的吞噬量。采用常規MTT法對PolyG1-GNPs和PolyG2-GNPs的細胞毒性進行了考察。如圖3B所示，分別與5、25和50 μg/mL的ssDNA-GNPs孵育24 h后，HeLa細胞的活率均能夠達到90%以上，表明所合成的ssDNA-GNPs具有較低的細胞毒性， 對HeLa細胞的生長狀態影響較小。

圖3 (A)不同條件下HeLa細胞對PolyG1-GNPs及PolyG2-GNPs的吞噬量; (B)PolyG1-GNPs及PolyG2-GNPs的細胞毒性。Fig.3 (A) Cellular internalization amounts of PolyG1-GNPs and PolyG2-GNPs by HeLa cells under different experimental conditions; (B) cytotoxicity test of G1-GNPs and PolyG2-GNPs

3.3 ssDNA-GNPs在細胞中的分布

GNPs的紫外-可見吸收光譜與其聚集狀態密切相關。為了考察HeLa細胞作用后ssDNA-GNPs膠體穩定性，收集了細胞內吞的ssDNA-GNPs并進行紫外-可見吸收光譜測定。如圖4A所示， PolyG1-GNPs的顏色由紅色變為紫色，SPR峰由523 nm紅移至537 nm，并在635 nm處出現一個新的吸收峰，表明PolyG1-GNPs發生了聚集。同樣條件下，PolyG2-GNPs的顏色和特征光譜均未發生顯著變化。這表明PolyG2-GNPs在細胞中的穩定性優于PolyG1-GNPs。這一現象可能是由于具有G四鏈體二級結構的PolyG2對DNA酶的穩定性優于線性的PolyG1導致的。如圖4B所示，ssDNA-GNPs主要分布于溶酶體中， 并且PolyG1-GNPs在溶酶體中量大于PolyG2-GNPs。另外，PolyG2-GNPs在細胞內的分散性優于PolyG1-GNPs。TEM結果與PolyG1-GNPs 和 PolyG2-GNPs的紫外-可見吸收光譜分析一致。

圖4 (A)細胞吞噬的PolyG1-GNPs 和 PolyG2-GNPs的紫外-可見吸收光譜圖，插圖為PolyG1-GNPs (上) 和 PolyG2-GNPs(下)照片; (B)PolyG1-GNPs 和(C) PolyG2-GNPs細胞TEM分析。ssDNA-GNPs在細胞內的分布如箭頭所示Fig.4 (A) UV-vis absorption spectra of PolyG1-GNPs and PolyG2-GNPs after interaction with HeLa cells, the inset of (A) is the digital photographs of PolyG1-GNPs (up) and PolyG2-GNPs (bottom); TEM images of (B) PolyG1-GNPs and (C) PolyG2-GNPs in HeLa cell. The cellular dispersed ssDNA-GNPs are indicated by arrows

4 結 論

兩種不同構型且含富含G堿基ssDNA修飾的GNPs與HeLa相互作用的比較結果表明，DNA的二級結構能夠影響ssDNA-GNPs與細胞的相互作用。盡管細胞對ssDNA-GNPs的內吞均與能量相關，但含有G四鏈體二級結構的ssDNA能夠促進細胞對ssDNA-GNPs的內吞，并且其所修飾的GNPs在細胞內具有較好的分散性與穩定性。本研究為設計高效ssDNA-GNPs納米探針/藥物載體提供了新思路。