利用組織芯片技術(shù)研究SHIP2蛋白在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義*

倪慧慧 王炳芳

1.江蘇大學(xué)附屬昆山市第一人民醫(yī)院感染科 (江蘇 昆山， 215300) 2.江蘇大學(xué)附屬昆山市第一人民醫(yī)院消化科

含SH2結(jié)構(gòu)域的肌醇多磷酸5′-磷酸酶-2(SHIP2)是Pesesse等(1997)[1]發(fā)現(xiàn)的一種蛋白酶，屬于肌醇多磷酸5′磷酸酶家族系列，我們采用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法，對42例原發(fā)性肝細(xì)胞癌及30例癌旁正常肝組織SHIP2蛋白的表達(dá)及其意義進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2002年至2011年原發(fā)性肝癌標(biāo)本42例，其中男27例，女15例；年齡范圍(28～75)歲，平均年齡(52.2±14.6)歲，≥60歲18例，<60歲24例；高分化19例，中分化14例 ，低分化9例；有門靜脈癌栓28例，無門靜脈癌栓14例。對照組癌旁正常肝組織30例，男21例，女9例；年齡范圍(26～77)歲，平均年齡(53.4±13.8)歲，≥60歲11例，<60歲19例；其中高分化15例，中分化10例 ，低分化5例；有門靜脈癌栓21例，無門靜脈癌栓9例；兩組人群基本情況比較P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2 主要試劑 鼠抗人SHIP2單克隆抗體和免疫組化試劑盒均購自上海今邁生物科技有限公司。

1.3 組織芯片制作 手術(shù)切除標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，首先在HE染色切片上進(jìn)行定位，應(yīng)用購自西安艾麗娜生物科技有限公司制作儀取材，制成兩塊組織芯片模塊，選取癌組織84個位點(diǎn)，癌旁正常肝組織60個位點(diǎn)，取樣針直徑2 mm，制作2個芯片蠟塊，以4μm厚度連續(xù)切片，敷貼于經(jīng)1%多聚賴氨酸處理的載玻片，各取1張進(jìn)行HE染色供形態(tài)學(xué)觀察，其余切片行免疫組化檢測。

1.4 試驗(yàn)方法和結(jié)果判斷 免疫組化采用IHC染色方法，觀察整張組織切片，每個芯片在電鏡下隨機(jī)選擇四域，并采用免疫組化染色陽性率評分(IHS)。IHS是由染色強(qiáng)度和密度確定評價(jià)。染色強(qiáng)度評分如下：0(負(fù))，1(弱陽性)，2(中正)，和3(強(qiáng)陽性)。SHIP2陽性細(xì)胞百分率也根據(jù)以下評分分為四類：1分代表0到10%，2分是11%到50%，3分是51%到80%，和4分代表81%到100%。強(qiáng)度的總和的百分比分?jǐn)?shù)得出最終的IHS：總分低于3的樣本(IHS≤3)被認(rèn)為是低SHIP2表達(dá)，為陰性表達(dá)。而以總分4以上(IHS≥4)為高SHIP2表達(dá)，為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用STATA 12.0版統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，采用統(tǒng)計(jì)方法有卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)等。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織與癌旁肝組織中SHIP2表達(dá)的比較 肝細(xì)胞癌組織中SHIP2陽性表達(dá)率顯著高于癌旁肝組織(P<0.01),見表1，及插頁彩圖1。

表1 肝細(xì)胞癌組織與癌旁肝組織中SHIP2表達(dá)的比較 (n)

2.2 原發(fā)性肝細(xì)胞癌5年生存者與死亡者SHIP2表達(dá)情況 見表2。

表2 原發(fā)性肝細(xì)胞癌5年生存者與死亡者SHIP2表達(dá)的比較 [n(%)]

42例肝細(xì)胞癌患者中存活5年的有28例，死亡的有14例，發(fā)現(xiàn)死亡患者SHIP2陽性表達(dá)率在肝細(xì)胞癌五年生存率比較中顯著高于存活患者(P<0.01)。

3 討論

肝細(xì)胞癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，近20年來其發(fā)病率顯著上升。盡管肝癌的治療包括外科治療，放化療及生物治療，但近十年來其5年生存率無顯著提高，這與腫瘤的轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)有密切聯(lián)系[2]。肝癌的產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個多因素、多基因參與的復(fù)雜生物學(xué)過程，在此過程中，腫瘤相關(guān)基因及其產(chǎn)物的非正常表達(dá)可引起細(xì)胞異常增殖、分化和凋亡，最終導(dǎo)致癌變發(fā)生[3,4]，因此尋找與肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)的基因具有重要意義。

SHIP2的是一種脂質(zhì)磷酸酶，全名為SH2域肌醇磷酸酶，最早發(fā)現(xiàn)其作用是負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素敏感性，并且參與磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)信號途徑。PI3K/Akt參與腫瘤的生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[5,6]。SHIP2可在PI3K/Akt下游通路中使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化而產(chǎn)生異常脂質(zhì)蛋白產(chǎn)物,從而干擾正常信號通路表達(dá)。近年研究表明，SHIP2可能與乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良相關(guān)[7，8]。以上研究表明SHIP2可作為乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的臨床診斷和預(yù)后判斷的潛在標(biāo)志物，而且可作為腫瘤新型靶向治療的候選基因。SHIP2表達(dá)與肝細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系目前尚無報(bào)道，SHIP2與肝細(xì)胞癌的關(guān)系目前仍無統(tǒng)一定論[9]。

組織芯片(TMA)是繼基因芯片和蛋白質(zhì)芯片之后出現(xiàn)的又一種重要的生物芯片技術(shù)，是后基因組時代基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要方法之一，具有高通量、節(jié)約組織原材料和檢測試劑、實(shí)驗(yàn)條件一致性及實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性好、實(shí)驗(yàn)誤差小等有優(yōu)點(diǎn)，組織芯片技術(shù)在腫瘤研究中可用于驗(yàn)證基因的特異表達(dá)、抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)的篩選、突變體和多態(tài)性的檢測以及腫瘤的分子診斷等方面。對于發(fā)生、發(fā)展過程呈多階段性，并涉及多種基因異常的腫瘤如HCC的研究，組織芯片技術(shù)有其突出的優(yōu)勢。組織芯片在腫瘤研究中有廣闊的應(yīng)用前景，免疫組織化學(xué)技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤病理診斷，具有定位準(zhǔn)確、直觀性強(qiáng)，形態(tài)與功能相結(jié)合的特點(diǎn)。本研究中，我們選擇SHIP2作為靶基因，通過IHC染色方法分析確認(rèn)SHIP2在肝細(xì)胞癌中的高表達(dá)。使用組織芯片免疫組織化學(xué)方法觀察SHIP2在肝癌中的表達(dá)，并根據(jù)組織芯片建立的肝癌病人數(shù)據(jù)庫，對原發(fā)性肝細(xì)胞癌五年生存率中SHIP2表達(dá)進(jìn)行比較，分析SHIP2與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療提供理論依據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)42例肝細(xì)胞癌組織檢測到21例(50.00%)具有SHIP2高表達(dá)，30例匹配的癌旁肝組織中6例(20.00%)。結(jié)果顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.7200，P< 0.01),而SHIP2陽性表達(dá)率在肝細(xì)胞癌五年生存率比較中死亡患者高于存活患者((χ2=6.857，P<0.01)。這表明與乳腺癌細(xì)胞一樣，SHIP2的超高表達(dá)可能與原發(fā)性腫瘤細(xì)胞相關(guān)[7]。我們的研究結(jié)果顯示在肝癌患者中肝癌組SHIP2高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)。在肝細(xì)胞癌中SHIP2對肝細(xì)胞癌的預(yù)后和治療價(jià)值和作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)和闡明。