不同種類老山芹總酚和總黃酮含量及抗氧化能力的初步研究

蔣欣梅孫天宇劉漢兵雷 楊程 瑤于錫宏趙恒田

（1東北農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030；2林下經(jīng)濟資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江哈爾濱 150040；3中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱 150040）

老山芹（Heracleum moellendorffii Hance.）也稱短毛獨活、興安獨活等，為傘形科獨活屬亞寒帶地區(qū)常見的草本野生蔬菜，在中國東北、韓國、朝鮮、俄羅斯遠東地區(qū)廣泛分布（李富恒 等，2017）。因其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，表現(xiàn)出很強的抗氧化能力，同時對風濕類病狀、“三高”問題具有顯著的食療效果（王金華 等，2017）。豐富的多酚是老山芹發(fā)揮醫(yī)藥和保健作用的重要活性成分之一。植物多酚（包括黃酮）廣泛存在于植物的根、莖、葉等部位中，既可影響食物的風味（多酚味酸、澀），同時也與抗氧化、抗心血管疾病、抗腫瘤等生物活性密切相關(guān)（Toda，2005）。此外，黃酮類物質(zhì)（槲皮素）對大腸桿菌等細菌也具有抑菌或殺菌作用（Vaquero & de Nadra，2008）。

目前國內(nèi)對老山芹的研究多集中在自然生境和栽培條件等方面以及總酚類物質(zhì)含量積累上，關(guān)于老山芹多酚類物質(zhì)與抗氧化能力之間的關(guān)系尚未見報道。本試驗以葉柄及葉脈部位分別為綠色、紅色及混合色的3份老山芹為試驗材料，采用比色法分別測定葉片和葉柄總酚和總黃酮含量，利用OH·、DPPH·、ABTS+等3種常用抗氧化能力評價方法，分析醇提物濃度與其抗氧化能力的關(guān)系，旨在為篩選合適的老山芹材料進行深入的功能性研究與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室經(jīng)多年馴化獲得的性狀穩(wěn)定的葉柄及葉脈部位分別表現(xiàn)為綠色、紅色及混合色的3份材料，分別為綠色老山芹、紅色老山芹、混合色老山芹。

儀器：酶標儀Biotek Elx800；分析天平Sartorius CPA225D；酸度計Sartorius PB-10。

1.2 試驗方法

2017年9月16日，在東北農(nóng)業(yè)大學向陽試驗基地，選擇株高25 cm左右、二年生展葉期的老山芹植株，采摘距地面約20 cm處長勢良好的葉作為樣品。取樣時，每份材料隨機選取20株植株的葉，將葉片和葉柄分開后分別混合，保存在-80 ℃冰箱中備用，每處理3次重復(fù)?？偡?、總黃酮含量以及與抗氧化能力相關(guān)指標（OH·清除能力、DPPH·清除能力、ABTS+清除能力）于東北農(nóng)業(yè)大學蔬菜生產(chǎn)設(shè)施工程與環(huán)境實驗室進行測定。

老山芹葉片、葉柄醇提物的制備：分別將老山芹樣品與70%乙醇按1∶10（質(zhì)量比）用粉碎機粉碎1 min，搖床振蕩（28 ℃，180 r·min-1）提取16 h，8 000 r·min-1離心15 min，取上清液，10倍梯度稀釋，待測。

總酚含量測定采用Folin酚法，總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法（Jia et al.，1999）；OH·清除能力測定參照Zhou等（2009）的方法，DPPH·清除能力、ABTS+清除能力測定參照Yolanda等（2014）的方法；計算樣品醇提物對自由基的清除率。

半清除率（抑制率）IC50的計算：IC50指清除率（抑制率）為50%時所需樣品液濃度，用來表示抗氧化劑清除自由基能力抑制活性。將樣品溶液配制成不同濃度梯度的溶液，測定各濃度樣品液清除率（抑制率），繪制清除率（抑制率）-樣品濃度曲線，由曲線讀出或用方程計算出IC50。濃度越低，表明清除能力（抑制活性）越強。以抗壞血酸為對照，濃度分別為61.25、50.99、75.39 mg·L-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)分析，運用Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性分析，運用Pearson相關(guān)系數(shù)法進行相關(guān)性分析；采用Microsoft Excel 2010軟件進行線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類老山芹的總酚、總黃酮含量

如圖1所示，不同種類、不同部位的老山芹總酚含量和總黃酮含量總體上呈現(xiàn)出顯著性差異。3種老山芹材料葉片中的總黃酮含量和總酚含量均顯著高于葉柄，葉片中總酚含量為124.41～317.61 mg·g-1，總黃酮含量為 184.37～278.82 mg·g-1；葉柄片中總酚含量為30.52～62.79 mg·g-1，總黃酮含量為77.09～112.52 mg·g-1。不同種類老山芹葉片中總酚含量由高到低依次為：紅色老山芹＞混合色老山芹＞綠色老山芹，且差異顯著；總黃酮含量由高到低依次為：混合色老山芹＞綠色老山芹＞紅色老山芹，差異亦達顯著水平。

圖1 不同種類老山芹葉片和葉柄中的總酚、總黃酮含量

2.2 不同種類老山芹醇提物的抗氧化能力

2.2.1 不同種類老山芹醇提物對DPPH·自由基的清除能力 從圖2和表1可以看出，3種老山芹葉片、葉柄醇提物均對DPPH·自由基有一定的清除效果，且在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，即DPPH·自由基清除率隨醇提物濃度的增加而升高。3種老山芹葉片醇提物對DPPH·自由基的清除能力均高于葉柄醇提物，清除DPPH·自由基的能力由大到小依次為紅色老山芹葉片＞混合色老山芹色葉片＞綠色老山芹葉片＞紅色老山芹葉柄＞混合色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉柄。其中，紅色老山芹葉片醇提物清除DPPH·自由基能力最強，濃度為0～1.00 g·L-1時對DPPH·自由基的清除率為0～89.66%，線性回歸方程為y=80.242x+6.821 9，R2=0.994 9，IC50為0.538 g·L-1，和目前普遍接受的抗氧化劑抗壞血酸（IC50=0.05 g·L-1）相比，紅色老山芹葉片具有一定的抗氧化能力；綠色老山芹葉柄醇提物對DPPH·自由基的清除能力最弱，濃度為0～3.27 g·L-1時的清除率為0～84.64%，線性回歸方程為y=23.287x+0.868 2，R2=0.986 8，IC50為 2.110 g·L-1。

圖2 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物對DPPH·自由基的清除效果

表1 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物清除DPPH·自由基的線性回歸方程和半清除率

2.2.2 不同種類老山芹醇提物對OH·自由基的清除能力 從圖3和表2可以看出，3種老山芹葉片、葉柄醇提物濃度與OH·自由基清除率之間呈線性關(guān)系，R2值均大于0.97。紅色老山芹葉片、混合色老山芹葉片醇提物對OH·自由基的清除能力明顯高于其他樣品；不同種類、不同部位老山芹醇提物對OH·自由基清除能力的次序與清除DPPH·自由基略有差異，依次為紅色老山芹葉片＞混合色老山芹葉片＞紅色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉片＞混合色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉柄；除綠色老山芹葉柄醇提物外，其他5份樣品對OH·自由基的清除能力均高于陽性對照抗壞血酸。

圖3 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物對OH·自由基的清除效果

表2 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物清除OH·自由基的線性回歸方程和半清除率

2.2.3 不同種類老山芹醇提物對ABTS+自由基的清除能力 從圖4和表3可以看出，隨著醇提物濃度的增加，不同種類、不同部位老山芹醇提物對ABTS+自由基的清除作用均增強，在一定濃度范圍內(nèi)兩者呈線性關(guān)系，R2值均大于0.98。3種老山芹葉片醇提物對ABTS+自由基的清除能力均高于相應(yīng)種類葉柄醇提物，由高到低依次為紅色老山芹葉片＞混合色老山芹葉片＞紅色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉片＞混合色老山芹葉柄＞綠色老山芹葉柄。

圖4 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物對ABTS+自由基的清除效果

表3 不同種類老山芹葉片、葉柄醇提物清除ABTS+自由基的線性回歸方程和半清除率

2.3 不同種類老山芹醇提物的抗氧化能力與總酚含量、總黃酮含量的相關(guān)性分析

從表4可以看出，老山芹葉片總酚含量與清除DPPH·、OH·、ABTS+自由基能力均呈極顯著正相關(guān)；葉柄總酚含量與清除OH·自由基能力呈極顯著正相關(guān)，與清除DPPH·、ABTS+自由基能力呈顯著正相關(guān)；葉片、葉柄總黃酮含量與抗氧化能力的相關(guān)性均不顯著。

表4 不同種類老山芹醇提物抗氧化能力與總酚含量、總黃酮含量的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，不同種類、不同部位老山芹的總酚含量、總黃酮含量大體上表現(xiàn)差異顯著。3種老山芹葉片的總酚含量及總黃酮含量均較高，其中紅色老山芹葉片總酚含量最高，達317.61 mg·g-1，高于高海榮等（2016）報道的10種茶葉茶多酚含量；混合色老山芹葉片總黃酮含量最高，達278.82 mg·g-1，與李琨等（2011）的試驗結(jié)果相似。張亮亮等（2013）研究表明，桑葉中多酚及黃酮含量與品種、葉位都有一定的相關(guān)性，不同品種桑葉中總酚和黃酮含量差異較大，葉片部位兩種成分含量高于葉脈和葉柄，品種間的差異可能取決于遺傳因素，葉位間的差異可能是由葉片成熟過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化引起。

本試驗中，紅色老山芹葉片醇提物的抗氧化活性最強，混合色老山芹葉片次之，綠色老山芹葉柄最弱，但6份樣品在各個評價體系中的抗氧化能力大小排序卻存在差異，這與董麗紅等（2016）的研究結(jié)果一致，不同的抗氧化體系可明顯影響酚類等活性物質(zhì)的抗氧化活性。相同提取液對不同自由基的清除效果亦有所不同，這一差異可能源于提取物中不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對不同自由基存在一定的選擇性（曹燕 等，2011）。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，老山芹葉片總酚含量與抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)，而總黃酮含量與抗氧化能力無顯著相關(guān)性。說明不同種類老山芹葉片中總酚類物質(zhì)含量差異是導(dǎo)致其提取物抗氧化活性不同的主要原因。事實上，許多多酚類物質(zhì)具有很好的抗氧化功能早已被發(fā)現(xiàn)和證實，這些化合物包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、花青素等（Mcdougall et al.，2005）。但老山芹葉片總酚中究竟是哪種化學成分在發(fā)揮抗氧化活性，尚有待進一步研究。