不同濃度DAPT對體外培養的糖尿病大鼠動脈血管平滑肌細胞增殖影響的研究

范東旭 劉彥東 薛金枝 王瀚銳 程明勛 金松

【摘要】目的 探討不同濃度DAPT對體外培養的糖尿病大鼠動脈血管平滑肌細胞增殖的影響，探尋適宜濃度，為研究糖尿病血管再生奠定基礎。方法 取已完成鑒定凍存的糖尿病大鼠血管平滑肌細胞，進行復蘇與傳代，分為實驗組和對照組。對照組不加抑制劑，實驗組不同濃度的DAPT（0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00μmol/L），觀察0、12、24、48、72 h后進行MTT監測。結果 DAPT對DM大鼠VSMCs有抑制作用，這種抑制作用在0.15～7.50 μmol/L濃度之間呈時間-濃度依賴性，差異有統計學意義（P<0.05），7.50 μmol/L濃度以上無明顯變化，無統計學意義（P>0.05）；根據作用曲線，各時間段DAPT對DM大鼠VSMCs細胞的半抑制率大約出現在0.15 ?mol/L和2.50?mol/L，且72小時時對DM大鼠VSMCs細胞的半抑制率較其余各時間段明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 DAPT對DM大鼠VSMCs有抑制作用，一定濃度之間呈時間-濃度依賴性，濃度過低或過高均無抑制作用，為糖尿病血管再生提供了新位點。

【關鍵詞】血管平滑肌細胞；體外原代培養；γ-分泌酶抑制劑（DAPT）；MTT

【中圖分類號】R363 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095.6681.2018.06.16..02

隨著糖尿病患者在血管外科患者中所占比例逐漸增加，引起血管外科醫生高度重視，對糖尿病患者血管再生的研究成為熱點，相關研究證明，Notch信號通路能促進非糖尿病動物缺血區的血管新生、動靜脈分化等，本課題應用不同濃度的γ-分泌酶抑制劑（DAPT）對Notch信號通路的關鍵酶γ-分泌酶進行抑制，探尋適宜血管再生的濃度，為進一步研究DM下肢缺血區血管新生提供實驗理論依據。

1 材料與試劑

1.1 組織來源

已完成鑒定凍存的糖尿病大鼠血管平滑肌細胞。

1.2 試劑

0.25%胰酶細胞消化液 invitrogen 公司，TRYPSIN 0.25%EDTA（25200056 Life），D-PBS （sh30028.01B Hyclone），D-Hanks液（不含Ca、Mg）（sh30030.03B Hyclone），γ-分泌酶抑制劑（DAPT）（美國Sigma公司），細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（MTT BB-4201貝博生物）。

1.3 培養基

在DMEM培養液（Gibco BRL，USA）培養基中添加15%胎牛血清（南美）（sv30087.02 Hyclone）、1%青霉素、1%鏈霉素，200目篩，一次性過濾除菌器除菌備用（4周內用完）。

1.4 器械及儀器

T25培養瓶，倒置顯微鏡，細胞計數板、超凈工作臺，96孔細胞培養板Corning Inc等。

2 方 法

2.1 細胞復蘇及傳代[1-2]

從液氮罐中取冷凍管，迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，使其1 min內完全融化，然后在超凈工作臺中打開凍存管，用吸管將細胞懸液注入離心管中，滴加10ml 培養液；然后1000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量培養液后接種于培養瓶中，接種濃度1*10g/L，置37℃ 5%CO2培養箱中培養，次日更換養液，繼續培養，觀察生長情況，若細胞在80%～90%融合時即可細胞傳代，以后根據情況在長滿1～2天后開始傳代；所有操作均在超凈工作臺中進行，將細胞懸液按1：2傳代培養，加入培養基懸浮細胞后，置37℃、5%C02培養箱中培養，每3 d換培養液一次，傳代至第3代時可進行MTT實驗。

2.2 MTT實驗[3]

用0.25%胰蛋白酶消化并收集DM大鼠VSMCs，計數細胞，制成細胞懸液。以2.0×104/ml、200 μl/孔接種于96孔板上，加入含20%胎牛血清的DMEM培養液，37℃，5%CO2培養箱中培養24小時。將γ-分泌酶抑制劑DAPT儲存溶液倍比稀釋為工作液終濃度分別為0.15、0.30、0.45、0.6、0.75、1.25、2.5、5、7.5、10、20 μmol/L，對照組不加，按濃度于96孔板上設置12排/板，共設置10個板；分別于0、12、24、48、72小時取出96孔板，每孔加入5 mg/ml MTT 20μl繼續培養4 h，終止培養，小心吸棄孔內上清；每孔加入150 μl DMSO：無水乙醇=1：1的混合液震蕩10分鐘，使結晶物充分溶解；在酶標儀上，以波長570 nm測定各孔光密度（Optical density，OD）值；以（OD測定孔-OD空白孔）表示每組的實際OD值；以正常對照組的細胞活力為100%，各實驗組的細胞活力=OD實驗組的實際值/OD對照組的實際值。

3 結 果

與對照組相比，不同濃度的DAPT（0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00μmol/L）對DM大鼠VSMCs有抑制作用，這種抑制作用在0.15～7.50μmol/L濃度之間呈時間-濃度依賴性，差異有統計學意義（P<0.05），7.50μmol/L濃度以上無明顯變化，無統計學意義（P>0.05）；根據作用曲線，各時間段DAPT對DM大鼠VSMCs細胞的半抑制率大約出現在0.15 ?mol/L和2.50 ?mol/L，且72小時時對DM大鼠VSMCs細胞的半抑制率較其余各時間段明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。

4 討 論

糖尿病血管并發癥是糖尿病患者主要致殘、致死原因[4]。流行病學調查研究表明，糖尿病患者發生心腦血管并發癥的危險性較正常人增加34倍，血管平滑肌細胞（VSMC）是動脈壁的主要組成成分，在糖尿病血管并發癥的動脈粥樣硬化形成中起著關鍵作用，因此對VSMC 的研究有著重要的意義。相關研究證明：Notch信號通路能促進非糖尿病動物缺血區的血管新生、動靜脈分化等；本課題證明題DAPT對DM大鼠VSMCs有抑制作用，這種抑制作用在0.15～7.50μmol/L濃度之間呈時間-濃度依賴性，差異有統計學意義（P<0.05），7.50 μmol/L濃度以上無明顯變化，無統計學意義（P>0.05）；根據作用曲線，各時間段DAPT對DM大鼠VSMCs細胞的半抑制率大約出現在0.15 ?mol/L和2.50 ?mol/L，且72小時時對DM大鼠VSMCs細胞的半抑制率較其余各時間段明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。證明Notch信號通路通過受體、配體、下游信號等各種蛋白共同作用下，在一定程度上可促進糖尿病患者下肢缺血區的血管再生，隨著對Notch信號通路研究的深入和對血管新生影響機制的闡明以及促血管或抑制血管新生方法的不斷完善，一定能為相關血管疾病治療提供重要策略和新的靶點。

參考文獻

[1] 楊 婷，金 松，劉彥東.糖尿病大鼠主動脈平滑肌細胞原代培養方法的改良[J].中國普外基礎與臨床雜志， 2014， 21（2）：173-176.

[2] 司徒鎮強.細胞培養[M].第二版.北京：世界圖書出版社，2007.

[3] 盧圣棟.現代分子生物學實驗技術[M].第二版.北京：中國協和醫科大學出版社，1999.439-441.

[4] Laakso M. Hyperglycemia and cardiovascular disease in type 2 diabetes[J].Diabetes，1999，48（5）：937-942.

本文編輯：吳宏艷