三種中國傳統(tǒng)干腌火腿中粗多肽的 抗氧化與抑菌活性的比較

鄭錦曉,邢路娟,周光宏,張萬剛

(肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省肉類生產(chǎn) 與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

金華火腿、宣威火腿和如皋火腿并稱為中國三大傳統(tǒng)干腌火腿。干腌火腿歷史悠久,具有豐富的營養(yǎng)價值[1]。干腌火腿加工時間一般長達(dá)8～10個月,三種傳統(tǒng)干腌火腿都經(jīng)歷了原料腿選擇、修整、腌制、洗腿、曬腿、發(fā)酵和成品階段,但腌制環(huán)境、發(fā)酵成熟時間和溫度等條件不同,產(chǎn)生的活性肽的活性可能存在差異[2-4]。在火腿加工過程中,火腿中的蛋白質(zhì)在內(nèi)源蛋白酶的作用下，發(fā)生水解而產(chǎn)生大量的多肽、小肽和氨基酸等[5]。Sforza等[6]研究表明,帕爾瑪火腿中含有大量小分子多肽。生物活性肽是指除其基礎(chǔ)的營養(yǎng)功能外,還可在生物體內(nèi)起重要的生理功能作用,發(fā)揮特定生理功能的肽類物質(zhì)[7]。活性肽在體內(nèi)的消化吸收性能明顯優(yōu)于單個氨基酸[8]。目前人們已從酪蛋白[9]、大豆蛋白[10]、膠原蛋白[11]中提取得到活性肽。據(jù)研究表明,干腌火腿中都存在生物活性肽,其具有抗氧化、降血壓、抑菌等活性。Zhu等[12]研究了金華火腿粗多肽的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)火腿中氨基酸序列為GKFNV的多肽起主要抗氧化作用。Xing等[13]在宣威火腿中發(fā)現(xiàn)粗多肽具有較高的抗氧化活性,并對進(jìn)行分離純化,鑒定出具有較高抗氧化活性的肽段 DLEE。Castellano等[14]對西班牙干腌火腿粗肽進(jìn)行分離并測定其抑制李斯特菌的能力,得到具有較好抑菌能力的肽段RHGYM。此外,Escudero[15]等對西班牙干腌火腿多肽進(jìn)行腎素抑制率的測定,發(fā)現(xiàn)小于1700 Da的小肽具有更強(qiáng)的降血壓活性。因而,傳統(tǒng)干腌火腿生物活性肽的研究主要集中于抗氧化與降血壓活性,分別涉及國內(nèi)金華火腿、宣威火腿及國外干腌火腿等,而在抑菌方面,未見有國內(nèi)干腌火腿多肽抑制微生物能力的研究。

關(guān)于中國三種傳統(tǒng)干腌火腿抗氧化活性及抑菌活性的比較分析還未見報道,因此本研究以金華火腿、宣威火腿、如皋火腿粗多肽作為研究對象,通過測定火腿抗氧化活性及抑菌活性,結(jié)合鹽含量及粗多肽氨基酸成分分析結(jié)果,比較三大火腿抗氧化和抑菌活性的差異,為進(jìn)一步探究火腿提取物生物活性功能的機(jī)理研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金華火腿 浙江金華市金年火腿食品有限公司;宣威火腿 云南省宣威市浦記火腿食品有限公司;如皋火腿 江蘇長壽集團(tuán),均選取經(jīng)過成熟發(fā)酵1年后的后腿部分,每種火腿隨機(jī)選取6塊,取股二頭肌部分進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并于4 ℃下保存;大腸埃希氏菌(Escherichiacoli) 中國微生物菌種保藏管理中心(No:21530);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;ORAC抗氧化試劑盒 美國Cell Biolabs公司;總抗氧化(ABTS法)試劑盒、總抗氧化(FRAP法)試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司;其他常用溶劑 均為國產(chǎn)分析純。

GM200刀式研磨儀 德國Retsch公司;T25勻漿機(jī) 德國IKA公司;冷凍干燥機(jī)德國 Christ公司;Spectral Max M2e多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司;UV-2450 日本島津公司;TG16-WS臺式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Mili-Q超純水系統(tǒng) 美國Milipore公司;Baker SG403A生物安全柜 美國Baker公司;Hitachi L-8900A氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 火腿含鹽量的測定 按照GB/T 9695.8-2008《肉與肉制品 氯化物含量測定》規(guī)定,采用Volhard法測定火腿中鹽的含量。利用熱水提取火腿肉中的氯化物,沉淀蛋白質(zhì),過濾后將濾液酸化,加入過量的硝酸銀,以硫酸鐵銨為指示劑,用硫氰酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過量的硝酸銀,計算出氯化鈉的含量。取10 g肉樣品加入到100 g水中,并置于沸水浴中15 min,待冷卻至室溫,依次加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液(106 g溶于1000 mL水中)與2 mL二水乙酸鋅溶液(220 g溶于30 mL冰乙酸,定容于1000 mL水中),靜置,過濾,吸取20 mL 濾液加入5 mL稀硝酸和1 mL硫酸鐵銨溶液作為指示劑,再加入20 mL硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mol/L),3 mL 壬醇,充分混勻,用硫氰酸鉀溶液(0.1 mol/L)滴定,直至出現(xiàn)穩(wěn)定的粉紅色,記錄體積。

式(1)

式中:V2指空白實(shí)驗(yàn)消耗體積數(shù);V1指樣品測定中消耗體積數(shù);C指硫氰酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。

1.2.2 粗肽粉的提取 參照王娟等[16]的方法并稍作修改。取股二頭肌的火腿成品25 g,經(jīng)研磨儀絞碎成渣后放入離心瓶,加入100 mL磷酸緩沖溶液(pH為7.2),勻漿(22000 r/min)3次,每次10 s。在4 ℃條件下靜置2 h,靜置后離心(4 ℃,12000×g,20 min),吸取上清液,加入3倍體積的乙醇(v∶v,40%),靜置12 h。再次離心(4 ℃,12000×g,20 min)。冷凍干燥后,在分析測試前將樣品保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.3 粗肽粉的肽含量的測定 參照Church等[17]的方法,將粗肽粉分別配制成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0 mg/mL的粗肽液,取40 mg鄰苯二甲醛溶于1.0 mL甲醇,依次加入25 mL 100 mmol/L硼砂,2.5 mL 20%(w/w)十二烷基硫酸鈉和100 μLβ-巰基乙醇,用超純水定容為50.0 mL,配制成鄰苯二甲醛混合液;取150 μL待測樣品與3.0 mL鄰苯二甲醛混合液混合,在室溫下精確反應(yīng)2 min,用酶標(biāo)儀測定其在340 nm波長下的吸光值。并以胰酪蛋白胨作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,配制等梯度濃度的溶液,測定其吸光值,繪制胰酪蛋白胨標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.4381x+0.1295,R2=0.9932)后，計算三種火腿提取物中肽的含量。

1.2.4 氨基酸成分分析 取冷凍干燥后樣品進(jìn)行氨基酸成分分析,參照Dong等[20]采用氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定。肽液用6 mol/L鹽酸水解24 h(110 ℃),然后將水解液蒸干,用氨基酸自動分析儀進(jìn)行氨基酸組成的測定。

1.2.5 清除DPPH自由基的能力 清除DPPH自由基能力的測定參照Orban等[18]的方法并作修改。將三種火腿粗肽液分別配制成質(zhì)量濃度為1.0～5.0 mg/mL的肽液,并取1 mL待測肽液與1 mL濃度為0.2 mmol/L的無水乙醇 DPPH溶液混合,振蕩混勻,在室溫下放置30 min,測定反應(yīng)物在517 nm波長下的吸光度值,記為A1;1.0 mL濃度為0.2 mmol/L的 DPPH無水乙醇溶液與1.0 mL無水乙醇混合物反應(yīng)記為對照組A2;空白組為1.0 mL肽液與1.0 mL 無水乙醇混合,記為A0。DPPH自由基的清除率計算如下:

式(2)

式中:空白組為A0;實(shí)驗(yàn)組為A1;對照組為A2。

1.2.6 鐵離子還原能力(FRAP) 鐵離子還原能力的測定,參照碧云天總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP)說明書。

1.2.7 清除ABTS+自由基能力 清除ABTS+自由基能力的測定,參照碧云天總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS)說明書。

1.2.8 氧自由基吸收能力(ORAC) 氧自由基吸收能力的測定,詳見Cell Biolabs總抗氧化試劑盒(ORAC)說明書。

1.2.9 大腸桿菌抑制能力 首先對粗肽液進(jìn)行超濾處理,截留分子量為3 KDa以下的肽液進(jìn)行凍干。參考張順亮等[19]的研究方法,測定大腸桿菌的抑菌活性,以抑菌率表示。將菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期并用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,濃度調(diào)整為1.0×106CFU/mL,按照1∶4 (V∶V),吸取細(xì)菌培養(yǎng)液500 μL至2 mL無菌PBS中,為對照組。實(shí)驗(yàn)管中加入500 μL細(xì)菌培養(yǎng)液與2 mL經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾的多肽溶液,同時振蕩培養(yǎng)(37 ℃ 150 r/min 1 h),之后對菌液進(jìn)行梯度稀釋,取100 uL涂布于計數(shù)平板上,37 ℃培養(yǎng)24h,計算菌落總數(shù)。計算公式如下:

抑菌率(%)=(N0-N1)/N0

式(3)

式中:N0為對照管細(xì)菌菌落總數(shù);N1為實(shí)驗(yàn)管細(xì)菌菌落總數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。方差分析采用SAS 8.0中one-way ANOVA來分析,通過Duncan’s Multiple-Range Test比較單個均值之間的差異性(p<0.05),實(shí)驗(yàn)重復(fù)數(shù)為6。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種干腌火腿的氯化鈉含量與肽含量

表1列出了三種干腌火腿氯化鈉含量和通過磷酸鹽法提取的粗多肽中肽的含量。由表1可知,氯化鈉含量方面,如皋火腿含量最高,金華火腿次之,宣威火腿含量最低(p<0.05)。肽含量方面,宣威火腿顯著高于如皋火腿(p<0.05)。鹽含量的高低和肽含量的多少與火腿生產(chǎn)環(huán)境和發(fā)酵成熟的工藝密切相關(guān)?；鹜戎械牡V物質(zhì)離子主要是鈉離子,其可賦予火腿以咸味,火腿中的食鹽含量和火腿的pH會影響火腿的咸度,火腿中的食鹽含量與腌制用鹽量、腌制方法及腌制條件等因素有關(guān)[21]。除用鹽量存在差異外,三種干腌火腿上鹽時間也存在差異,宣威火腿和金華火腿上鹽時間1個月,而如皋火腿上鹽時間長達(dá)2個月[3-4,22],致使如皋火腿含鹽量高于其他兩種干腌火腿。此外,干腌火腿內(nèi)源蛋白酶活性的強(qiáng)弱,發(fā)酵時間的長短也會影響火腿粗多肽的生成,內(nèi)源酶的活力受限于溫度、pH及鹽分的高低等,鹽含量越高,酶的活力會降低,這也可能是導(dǎo)致宣威火腿中粗多肽的肽含量顯著高于金華火腿和如皋火腿的原因。

表1 三種干腌火腿粗多肽氯化鈉含量及肽含量Table 1 Salt content and peptide content of crude peptide from three dry-cured hams

2.2 三種干腌火腿中粗多肽氨基酸成分分析

由表2可知,通過磷酸鹽提取法獲得的三種干腌火腿粗多肽中Glu、Asp、Arg和Lys的含量較高,均超過2.0 g/100 g,其中Glu含量最高,約占干腌火腿水解氨基酸總量的1/6。趙改名等[21]的研究表明干腌火腿中含有豐富的Glu和Lys等氨基酸,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。通過三種干腌火腿粗多肽中相同氨基酸含量的比較可知,宣威火腿粗多肽中Pro和Thr的含量顯著高于其他兩種火腿,金華火腿粗多肽中His和Arg的含量顯著高于其它兩種火腿(p<0.05);宣威火腿與如皋火腿粗多肽中Asp和Trp的含量顯著高于金華火腿(p<0.05);宣威火腿與金華火腿粗多肽中Phe的含量顯著高于如皋火腿(p<0.05);金華火腿與如皋火腿粗多肽中Glu的含量顯著高于宣威火腿(p<0.05);宣威火腿粗多肽中Ser的含量顯著高于金華火腿(p<0.05),宣威火腿粗多肽中Val、Gly及Ile的含量顯著高于如皋火腿(p<0.05),如皋火腿粗多肽中Thr的含量顯著高于金華火腿(p<0.05)。而三種火腿粗多肽中Ala、Met、Leu及 Lys的含量沒有顯著差異(p>0.05)。

生物活性肽的活性功能與其一級結(jié)構(gòu)和氨基酸的組成密切相關(guān)[23]。有研究表明,ACE抑制肽末端氨基酸多含有Tyr和Pro等[24],而抗氧化肽的活性大小主要與肽序列中的疏水性氨基酸、酸性氨基酸、抗氧化性氨基酸及肽分子結(jié)構(gòu)有關(guān)[25]。抑菌肽的活性主要受序列中的疏水性殘基影響,如Ala、Leu或Trp等[26]。對比表中疏水氨基酸的含量可知,宣威火腿粗多肽中Leu、Val、Pro、Ala和Trp、Tyr、Phe疏水性氨基酸的總含量為8.06 g/100 g,顯著高于如皋火腿粗多肽(6.93 g/100 g)和金華火腿粗多肽(6.68 g/100 g)(p<0.05)。疏水性氨基酸殘基越多,能夠促進(jìn)多肽與生物體內(nèi)脂質(zhì)的結(jié)合,增強(qiáng)抗氧化活性[27]。如皋火腿粗多肽Asp和Glu(酸性氨基酸)的含量(6.41 g/100 g)與金華火腿粗多肽(5.98 g/100 g)無顯著差異(p>0.05)。如皋火腿粗多肽Trp、Tyr、Met和His(抗氧化氨基酸)的含量(3.26 g/100 g)與宣威火腿(3.44 g/100 g)和金華火腿(3.11 g/100 g)沒有顯著差異(p>0.05)。這些抗氧化氨基酸如Lys和His,以單個氨基酸形式存在時也具有一定的抗氧化活性,但其活性往往低于以肽段組成的抗氧化肽[28]。

抑菌肽的分子量一般小于7000 Da,在肽的N端通常含有較多的堿性氨基酸,如Lys和His等[29],三種火腿粗多肽Lys的含量沒有顯著差異(p>0.05),金華火腿粗多肽中His的含量顯著高于宣威火腿和如皋火腿(p<0.05)。而抑菌肽的C端氨基酸通常呈中性和疏水性,含Ala和Val等非極性氨基酸,中間部分則富含Pro[30]。表2中可知,宣威火腿粗多肽Val的含量顯著高于如皋火腿(p<0.05)。

表2 三種干腌火腿粗多肽氨基酸成分分析Table 2 Amino acids composition analysis of three crude peptides

2.3 三種干腌火腿粗多肽抗氧化能力的比較

圖1顯示三種粗肽液在不同濃度下清除DPPH自由基能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過圖1可知,三種干腌火腿粗多肽都具有一定的DPPH自由基清除能力,且隨濃度的升高清除能力逐漸增強(qiáng)。宣威火腿粗肽液在1.0 mg/mL的濃度下,清除DPPH自由基能力顯著高于其他兩種粗肽液,在2.0 mg/mL時,宣威火腿粗多肽的清除能力顯著弱于其他兩種粗多肽(p<0.05),在3.0和4.0 mg/mL時,三種粗多肽清除能力沒有顯著差異(p>0.05)。DPPH法的原理是測定抗氧化物提供氫原子給DPPH自由基以猝滅自由基的能力[25]。干腌火腿粗多肽中含有Trp和Tyr具有很好的供氫能力,可將氫原子提供給自由基,從而形成苯氧自由基和吲哚自由基等穩(wěn)定的中間產(chǎn)物,減慢或停止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[31]。結(jié)合表2中氨基酸成分分析,宣威火腿疏水性氨基酸含量最多,使得宣威火腿粗肽液在1.0 及5.0 mg/mL 的濃度下,清除效果最好。此外,三種火腿都含有一定量的Trp和Tyr,宣威火腿粗多肽的Trp和Tyr含量顯著高于金華火腿(p<0.05),在一定程度上可以解釋宣威火腿粗肽液的DPPH自由基清除效果強(qiáng)于金華火腿。

圖1 不同質(zhì)量濃度粗肽液清除DPPH自由基的能力Fig.1 The effect of different concentrations of crude peptides on the DPPH radical scavenging abilities注:不同字母表示相同質(zhì)量濃度下不同粗多肽 之間有顯著差異(p<0.05);圖2同。

圖2 不同質(zhì)量濃度粗肽液抑制大腸桿菌的能力Fig.2 The effect of different concentrations of crude peptide on the inhibitory of Escherichia Coli

表3列出了三種火腿粗多肽鐵離子還原能力、ABTS+自由基清除能力和氧自由基清除能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。ABTS+自由基清除能力和氧自由基清除能力是測定清除自由基能力的常用指標(biāo),鐵離子還原能力是測定抗氧化劑的還原能力常用的方法[32]。結(jié)合三種抗氧化方法分析三種火腿粗多肽的抗氧化能力可知,宣威火腿粗多肽抗氧化能力最強(qiáng),顯著高于金華火腿及如皋火腿粗多肽(p<0.05)。金華火腿粗多肽氧自由基清除能力及鐵離子還原能力顯著高于如皋火腿粗多肽(p<0.05),而如皋火腿粗多肽ABTS+自由基清除能力與金華火腿粗多肽無顯著差異(p>0.05)。短肽中特定氨基酸的組成,為粗肽液提供了較強(qiáng)的抗氧化能力。由表2可知,火腿粗肽液中含有的Cys是一種良好的巰基親核試劑,具有捕獲自由基的能力,His中的咪唑基具有供氫能力,能螯合金屬離子和碎滅活性氧自由基而達(dá)到抗氧化效果[33]。

結(jié)合表2與表3分析可知,宣威火腿特定氨基酸含量,如疏水性氨基酸含量,某些抗氧化氨基酸(Trp、Tyr、Met)含量較高,使得宣威火腿粗肽液自由基清除能力最強(qiáng)。另外,金華火腿粗多肽His與Cys的含量顯著高于如皋火腿(p<0.05),而如皋火腿粗多肽中Trp的含量顯著高于金華火腿(p<0.05)。這些特定氨基酸的種類及數(shù)量導(dǎo)致了三種干腌火腿粗多肽抗氧化活性的差異,而目前對抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系和復(fù)雜的作用機(jī)制尚未完全清楚,多肽的抗氧化活性還可能受肽鏈的長度、末端氨基酸組成及周圍環(huán)境的影響[25]。因此,三種抗氧化指標(biāo)中只有鐵離子還原能力與氧自由基清除能力上顯示金華火腿粗肽液清除效果顯著強(qiáng)于如皋火腿(p<0.05),而ABTS+自由基清除能力上,如皋火腿粗多肽的清除效果與金華火腿粗多肽無顯著差異(p>0.05)。

2.4 三種干腌火腿中粗多肽抑制大腸桿菌能力的比較

圖2列出了三種干腌火腿中3000 Da分子量以下的粗肽抑制大腸桿菌的效果。由圖2可知,抑制大腸桿菌的能力隨著肽濃度的升高而增大,在0.5 mg/mL時,如皋火腿粗肽液抑菌能力顯著弱于其他兩種(p<0.05),在1.0、1.5 mg/mL時,宣威火腿與如皋火腿粗肽液的抑菌能力顯著強(qiáng)于金華火腿粗肽液(p<0.05),三種粗肽液在2.0 mg/mL時沒有顯著差異(p>0.05),且抑制率接近100%。粗多肽抑菌效果也與氨基酸組成與含量密切相關(guān),尤其受疏水性氨基酸的影響。有研究表明,抗菌肽平均長度為18個氨基酸殘基[34],大腸桿菌(E.coli)結(jié)構(gòu)簡單,細(xì)胞壁是由一層肽聚糖構(gòu)成,粗肽液中的肽段可能通過復(fù)雜的機(jī)制抑制靶細(xì)胞壁組分的合成或是破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),從而抑制大腸桿菌的生長[35]。除了具有疏水性氨基酸,抑菌肽中還富含Pro[36]。從表2中可以看出宣威火腿粗多肽Pro含量顯著高于其他兩種火腿(p>0.05)。此外,抑菌肽中還具有豐富的Arg,已知豬的 PR-39抗菌肽和牛抗菌肽中均富含有此類氨基酸[37]。金華火腿粗多肽中Arg的含量顯著高于如皋火腿粗多肽(p>0.05),這可能是導(dǎo)致金華火腿粗肽液在1.0、1.5 mg/mL時抑菌活性高于如皋火腿粗多肽的原因。

3 討論與結(jié)論

三種傳統(tǒng)干腌火腿加工過程都經(jīng)歷了修割、上鹽、腌制、洗腿、曬腿、成熟等階段,其中,成熟階段是火腿風(fēng)味物質(zhì)形成的重要時期。適宜的溫度與濕度有助于火腿的成熟,火腿的內(nèi)源蛋白酶降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生肽物質(zhì)。宣威火腿的加工地點(diǎn)在云南,春秋季長,干季氣候特征結(jié)合,且臨近夏季相對濕度的上升,相較浙江、江蘇地區(qū)緯度更低,加工環(huán)境的氣候條件更適宜,平均室溫在15～20 ℃之間,相對濕度在72%～80%之間,高于金華火腿發(fā)酵時期(相對濕度在55%～75%),可促進(jìn)酵母菌和青霉菌、曲霉菌、木霉菌等霉菌的生長,加速腿內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪等成分的水解和轉(zhuǎn)化,使火腿蛋白降解產(chǎn)生的肽物質(zhì)更多,其中含有的特定疏水性氨基酸殘基數(shù)量多,使宣威火腿多肽抗氧化及抑菌效果最好,關(guān)于其抗氧化及抑菌活性的內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

通過對宣威火腿、金華火腿、如皋火腿的氯化鈉含量、粗多肽的肽含量、抗氧化活性、抑菌活性分析和氨基酸成分分析可知,受加工環(huán)境條件的影響,導(dǎo)致宣威火腿粗肽含量高,疏水性氨基酸Leu、Val、Pro、Ala、Trp、Tyr和Phe的含量顯著高于其他兩種干腌火腿(p<0.05);氯化鈉含量最低,鐵離子還原能力和ABTS+自由基清除能力、氧自由基清除能力最強(qiáng),并且有抑制大腸桿菌,也有一定的清除DPPH自由基的能力。