響應面法優化虹鱒魚骨中 可溶性鈣提取工藝

楊淑曉,李 萌,馬永生,趙前程,*,馬 壯

(1.大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023； 2.新疆賽湖漁業科技開發有限公司,新疆博樂 833400)

鈣是人體中最豐富、最重要的礦物元素,在人體的正常生理代謝活動中具有極其重要的作用[1]。據我國膳食營養調查研究表明,在膳食營養素的攝入量中以鈣的缺乏最為明顯,供給量只有標準的50%[2]。鈣攝入不足將嚴重威脅人體健康,會引起肌肉痙攣、骨質疏松以及佝僂病等癥狀,因此補鈣已成為我國膳食中亟待解決的問題[3-4]。虹鱒(Oncorhynchusmykiss)作為聯合國糧農組織向世界推廣的四大淡水養殖品種之一的高檔魚,具有產量高、品質優良、營養豐富、人工養殖簡便的優點[5]。1959年,我國首次從朝鮮引進虹鱒,自此開始進行虹鱒養殖及加工生產,并不斷取得優異的經濟效益[6],年生產能力可達3萬噸[7]。但在其生產加工過程中,剩余了大量的副產物,包括魚頭、魚骨、魚鱗等,其中魚骨占到魚體的10%以上,利用率低造成大量資源浪費[8]。魚骨中含有豐富的礦物質(Ca、P、Zn、Fe、Cr、Se、Mn等)等,其中鈣磷比(1.53∶1)接近人體所需鈣磷比例,益于人體吸收,是一種良好的天然鈣資源,具有廣闊的開發前景[9-11]。

魚骨中的鈣質溶解度低,極易飽和和析出,大多控制在羥基磷灰石結晶(HA)的形態,因此采用簡單的物理方法(如常壓煮制法等)不能將其有效的溶出。近年來,國內外學者研究魚骨中可溶性鈣的提取方法主要有:酸法、堿法和酶法。而酸法被認為是一種良好的提取鈣的方法,具有提取率高,副作用小,成本低的優點[12-13]。

本研究以虹鱒魚骨為原料,系統的考察了影響可溶性鈣提取率的關鍵因子,利用電感耦合等離子體原子發射光譜法測定骨中的鈣,通過響應曲面法進行優化,確定最優的提取工藝。旨在為實現生產中對虹鱒魚骨資源的研究和開發提供了一定的應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

虹鱒魚排 新疆賽湖漁業科技開發有限公司提供;濃鹽酸 分析純,大連博諾試劑有限公司;濃硝酸 優級純,大連博諾試劑有限公司;鈣離子標準貯備液 1000 μg/mL,北京世紀奧科生物技術有限公司。

FD-1型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;Stratos全能臺式高速冷凍離心機 北京昊諾斯科技有限公司;鹽度計 日本ATAGO株式會社;ICP-OES Optima 8000型電感耦合等離子體原子發射光譜儀 美國Perkin Elmer儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 虹鱒魚骨粉的制備 虹鱒魚排經流水解凍后,除去雜質,切成段(2 cm×1 cm)。稱取一定質量,加入木瓜蛋白酶(用量為底物的3%),料液比為7∶1 (mL/mg),溫度45 ℃,水浴酶解3h,以消化脫除魚排上的魚肉,得到干凈無污漬的魚骨[14]。魚骨經冷凍干燥機凍干(-62 ℃)后,將其粉碎成骨粉,過100目篩,超純水洗至中性后二次凍干。

1.2.2 單因素實驗 稱取若干份1.000 g骨粉末,以鈣提取率W為指標,固定料液比為1∶4 (g∶mL),探究鹽酸濃度(mol/L)、提取時間(h)和提取溫度(℃)對可溶性鈣提取效果的影響[19]。選取鹽酸濃度(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mol/L)為可變單因素,料液比為1∶4 (g∶mL),提取溫度50 ℃,提取時間2 h;選取提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)為可變單因素,料液比為1∶4 (g∶mL),鹽酸濃度3 mol/L,提取時間2 h;選取提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 h)為可變單因素,料液比為1∶4 (g∶mL),鹽酸濃度3 mol/L,提取溫度50 ℃。

1.2.3 響應面優化試驗 由單因素實驗結果,采用Box-Behnken中心組合試驗模型,選擇鹽酸濃度、提取溫度、提取時間三個因素進行響應面優化試驗,其因素編碼表如表1所示。

1.2.4 鈣含量測定及可溶性鈣提取率的計算

1.2.4.1 骨粉中總鈣含量測定 參考GB 5009.92-2016濕法消解[15]。準確稱取骨粉0.2 g,于已泡酸(15%～18%硝酸)過夜的石英瓶中,加入10 mL濃硝酸,于電熱板上加熱消解(約200～300 ℃)2～3 h。取下靜置,待消化液冷卻后,用高純水定容至50 mL,混勻,0.22 μm過膜。利用電感耦合等離子體原子發射光譜儀檢測總鈣的含量,同時做空白試驗。

1.2.4.2 骨粉中可溶性鈣含量測定 將所有的待測樣品均在9000 r/min,4 ℃的條件下離心20 min后,取上清液用超純水定容至50 mL,混勻,0.22 μm過膜,利用電感耦合等離子體原子發射光譜儀檢測可溶性鈣的含量,同時做空白試驗。

1.2.4.3 ICP-OES儀工作條件 參考GB 5009.268-2016所述操作條件(電感耦合等離子體原子發射光譜儀測定部分)[16]。鈣元素分析譜線波長:317.933 nm;觀測方式;Radial觀測模式;功率:1300 W;等離子氣流量:12.0 L/min;輔助氣(Aux)流量:0.2 L/min;霧化氣體(Neb)流量:0.55 L/min;分析泵速:30 r/min

1.2.4.4 鈣標準曲線的繪制 參考GB 5009.92-2016進行繪制(電感耦合等離子體原子發射光譜儀測定部分)[15]。精確吸取一定體積鈣離子標準貯備液于試管中,用0.5%硝酸溶液逐級稀釋,配制成一定質量濃度梯度(0、0.0128、0.064、0.32、1.6、8、40 mg/L)的鈣標準工作液,利用電感耦合等離子體原子發射光譜儀,測定鈣離子分析譜線的信號強度值。橫坐標設定為鈣離子標準液的濃度,縱坐標設定為信號強度值,繪制標準曲線為:

y=73327.677x+4702.828R2=0.9998

式(1)

1.2.4.5 鈣含量的測定

式(2)

式中:N為鈣含量,mg/g;C1為樣品中鈣的質量濃度,mg/L;C0為空白樣中鈣的質量濃度,mg/L;V為樣品定容體積,mL;f為稀釋倍數;m為樣品質量,g[17-18]。

1.2.4.6 可溶性鈣提取率的計算

式(3)

式中:W為可溶性鈣提取率,%;N2為骨粉中可溶性鈣的含量,mg/g;N1為骨粉中總鈣的含量,mg/g。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 骨粉中可溶性鈣單因素實驗

2.1.1 鹽酸濃度對鈣提取率的影響 由圖1可知,鹽酸濃度為1.5～3.0 mol/L時可顯著增加骨粉中可溶性鈣的提取率(p<0.05)。濃度取值3.0 mol/L時,可溶性鈣提取率最高。此后增大鹽酸濃度,鈣提取率差異不顯著(p>0.05),逐漸趨于平衡(飽和)狀態。因此得出最適鹽酸濃度為3.0 mol/L。

圖1 鹽酸濃度對鈣提取率的影響Fig.1 Effect of the concentration of hydrochloric acid on the extraction rate of calcium注：圖中不同字母表示差異性顯著(p<0.05)； 相同字母為差異不顯著(p>0.05)；圖2、圖3同。

2.1.2 提取溫度對鈣提取率的影響 溫度影響反應體系中鹽酸分子的運動速率[20]。由圖2可看出,在30～50 ℃的區間內,升高溫度,骨粉中可溶性鈣的提取率增大(p<0.05),溫度升高到50 ℃時,鈣的提取率達到最大。繼續增高溫度至70 ℃,相比與60 ℃,鈣提取率會顯著下降(p<0.05)。這可能是由于鹽酸是強揮發性酸,鈣離子的溶出和鹽酸揮發兩個反應系統是相互獨立的,溫度升高,鹽酸分子的運動速率加快,揮發出大量鹽酸,使其實際濃度降低,影響可溶性鈣的提取。因此得出提取的最適溫度為50 ℃。

圖2 提取溫度對鈣提取率的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature on the extraction rate of calcium

2.1.3 提取時間對鈣提取率的影響 由圖3得出,提取時間在1.0～2.0 h時,骨粉中可溶性鈣的提取率隨時間的延長而增大。反應時間為2.0 h時,鈣提取率達最高值,隨著酸解時間的繼續增加(2.5～4.0 h),鈣提取率變化不顯著,而當提取時間達5.0 h時,與4.0 h相比,可溶性鈣的提取率呈略微下降(p<0.05)。這可能是在進行反應的同時,鹽酸不斷的揮發出,導致反應系統中鹽酸的實際濃度下降,不利于可溶性鈣的提取。因此得出提取的最佳時間為2.0 h。

圖3 提取時間對鈣提取率的影響Fig.3 Effect of the extraction time on the extraction rate of calcium

2.2 響應面優化試驗結果分析

表2列出了鹽酸進行酸解提取虹鱒魚骨可溶性鈣的設計方案及結果。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface design of results

利用Design Expert 8.0.5設計軟件對表2中的數據進行多元回歸擬合,得出二次多項回歸模型:

W(%)=28.28+0.93A-0.26B+0.19C+0.28AB+1.18AC+1.28BC-0.70A2-0.78B2-3.43C2

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Response surface analysis of variance

方差分析表中一次項A,交互項AC、BC及二次項C2對響應值鈣提取率的影響達到極顯著水平(p<0.01);二次項A2、B2達到顯著水平(p<0.05);一次項B、C及交互項AB則對響應值W影響不顯著(p>0.05),說明各試驗因素對響應值鈣提取率的影響不僅是呈現淺易的線性關系[23]。由以上推出,各因素對響應值鈣提取率的影響主效應順序為A>B>C,即鹽酸濃度對可溶性鈣的提取率影響最大,其次是提取溫度,提取時間則對響應值鈣提取率的影響最小。

2.3 響應曲面及等高線分析結果

基于該模型的多元二次線性回歸方程繪制各因子與響應值W對應的響應曲面和等高線圖,以進一步考察A、B、C三因素兩兩之間的交互作用對可溶性鈣提取率的影響,結果如圖4～圖6。響應曲面的走勢及坡度可體現試驗因素對響應值的影響,曲面走勢越陡峭,表明兩因素交互效應對響應值的影響越顯著,鈣提取率的改變越敏感;走勢越平緩則與之相反。等高線的形狀及疏密程度可表示出兩因素互作效應的強弱,橢圓形且曲線密集體現其互作效應對響應值的影響顯著,若圓形、曲線稀疏則影響不顯著[24-25]。

圖4 鹽酸濃度和提取溫度交互作用對鈣提取率的影響Fig.4 Hydrochloric acid concentration and extraction temperature interaction to calcium in the influence of extraction

圖5 鹽酸濃度和提取時間交互作用對鈣提取率的影響Fig.5 Hydrochloric acid concentration and extraction time interaction to calcium in the influence of extraction

圖6 提取溫度和提取時間交互作用對鈣提取率的影響Fig.6 Extraction temperature and extraction time interaction to calcium in the influence of extraction

如圖4～圖6可知,鹽酸濃度和提取溫度的互作效應對響應值W的影響不顯著;鹽酸濃度和提取時間的互作效應對響應值W的影響極顯著(p<0.01);提取溫度和提取時間的互作效應對響應值W的影響極顯著(p<0.01)。

以上每一對變量的交互效果表明,在提取可溶性鈣時,隨著鹽酸濃度、提取溫度及提取時間的增加,鈣提取率也趨向一個特定水平(最大值),高于該水平后,鈣提取率略微下降。可能是由于在較高鹽酸濃度、提取溫度和提取時間的條件下,鹽酸表現出較強的揮發性,促使鹽酸分子的運動速率加快,揮發出大量鹽酸,使其實際濃度降低,從而影響鈣的提取。

經研究,響應曲面若為開口向下的凸形曲線,且居于高、低水平之間存在最高點,說明響應指標值在所設定的自變量水平范圍內存在極大值,即此值為響應曲面的最高點,同樣也代表等高線中最小橢圓的中心點[26]。如圖5、圖6響應曲面均開口向下,走勢陡峭,等高線呈橢圓形且曲線較密集,結合表3，表明鹽酸濃度與提取時間、提取溫度和提取時間的交互效應影響極顯著(p<0.01);而圖4響應面接近于平面,等高線呈圓形且曲線稀疏,說明鹽酸濃度與提取溫度的交互效應影響不顯著,與方差分析的結果一致。

2.4 最佳工藝參數確定及驗證性試驗

通過軟件分析可知,鹽酸浸提虹鱒魚骨中可溶性鈣的最佳工藝條件為:鹽酸濃度3.44 mol/L,提取溫度51.60 ℃,提取時間2.10 h,在此優化條件下,可溶性鈣提取率可達28.68%。考慮實際操作的局限性及實用性,將最佳工藝最終修正為鹽酸濃度3.4 mol/L,提取溫度52 ℃,提取時間2.1 h。在此工藝條件下重復試驗三次,取平均值得鈣提取率為28.45%,與理論值相差0.23%,表明此回歸模型具有可靠性[27-28]。

3 結論

本試驗采用酸法提取虹鱒魚骨中可溶性鈣,用電感耦合等離子發射光譜法測定骨中鈣的含量,通過響應曲面分析確定單個因素的主效應順序為:鹽酸濃度>提取溫度>提取時間。經二次多項回歸模型確定最佳提取條件為鹽酸濃度3.4 mol/L,提取時間2.1 h,提取溫度52 ℃,此工藝下可溶性鈣提取率為28.45%,與預測理論值誤差小,說明此模型具有實際可操作性,為現實中綜合利用虹鱒魚骨資源提供了參考價值。