響應(yīng)面法優(yōu)化提取無花果干果中 多酚和總黃酮物質(zhì)及其抗氧化活性

張錦華,徐 蔓,白寶清,董 晨

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

無花果(FicuscaricaL.)系桑科落葉小喬木,是一種普遍生長的物種[1],特別是在溫暖干燥的氣候中[2]。無花果中富含礦物質(zhì)、維生素和膳食纖維,無膽固醇,并且含有大量的氨基酸[3]。與其他水果相似,無花果中含有豐富的糖類,含量最多的是葡萄糖、果糖、阿拉伯糖和半乳糖。而糖和淀粉會發(fā)生互變,往往會影響其口感和質(zhì)量。無花果中富含酚類物質(zhì),對其品質(zhì)有重要作用,特別是已被證明可對人體健康產(chǎn)生積極影響[4-5],能夠有效清除自由基、保護(hù)機(jī)體生物大分子以及抗腫瘤、抗動脈硬化等。無花果中同時含有黃酮類化合物,具有很好的化學(xué)反應(yīng)性,例如能夠清除生物體內(nèi)的自由基,具有抗氧化作用[6]。

目前國內(nèi)對無花果的研究主要集中在無花果葉中活性物質(zhì)的提取,新鮮無花果以及干無花果活性物質(zhì)的研究較少。國外對新鮮無花果和干無花果研究較多,Mostapha等[7]利用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)丙酮對淺色和深色干無花果中的酚類化合物進(jìn)行提取,得到淺色和深色干無花果中總酚最大提取量分別為469.46、399.79 mg/100 g。Mostapha等[8]又利用響應(yīng)面法對深色新鮮無花果酚類化合物提取進(jìn)行優(yōu)化,最終得到總酚提取量為536.43 mg/100 g。

新鮮無花果極易腐爛,因此大部分產(chǎn)品為干無花果,干無花果是世界上產(chǎn)量最高的水果產(chǎn)品之一。本文以干無花果為研究對象,通過響應(yīng)面優(yōu)化出干無花果中多酚和總黃酮類物質(zhì)提取的最優(yōu)工藝,并且將其與VC進(jìn)行抗氧化活性比較,同時考察模擬人體內(nèi)微環(huán)境對無花果多酚抗氧化活性的影響,為干無花果中活性物質(zhì)的有效提取提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ),并為進(jìn)一步研究干無花果中活性物質(zhì)組成提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乙醇、正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇 天津市進(jìn)豐化工有限公司;福林酚 北京索萊寶科技有限公司;Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、FeSO4、水楊酸、H2O2、Tris、HCl、KH2PO4天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;鄰苯三酚 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;以上試劑均為分析純;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、胃蛋白酶(酶活>250 U/mg)、胰蛋白酶(酶活>250 U/mg) 上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;DPPH 美國Sigma公司;無花果干果 購于太原市美特好超市。

UV-2800型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;GZX-9023MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JA1203N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SC-3614型低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海知信實(shí)驗儀器技術(shù)有限公司;XL-600B型多功能粉碎機(jī) 永康市小寶電器有限公司;SB-4200DT型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 無花果干果切小塊,在55 ℃烘箱放置24 h后,粉碎過60目篩,備用。

1.2.2 提取工藝 稱取經(jīng)預(yù)處理的原料(1.000±0.002) g放置于250 mL錐形瓶中,按料液比加入乙醇水提取溶劑,在設(shè)定的溫度和時間下進(jìn)行超聲波輔助提取[9]。提取完成后將粗提液經(jīng)抽濾后進(jìn)行減壓濃縮,并用蒸餾水定容至25 mL,得到提取物原液,4 ℃冰箱冷藏。

1.2.3 單因素實(shí)驗 固定條件為提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)60%,料液比1∶40,超聲溫度50 ℃,超聲時間50 min,分別改變提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲溫度和超聲時間,從而考察各變量對無花果干果中多酚和黃酮提取量的影響。研究中各因素的變化范圍分別為:乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%;料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60;超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃;超聲時間為30、40、50、60、70 min。

1.2.4 Box-Behnken試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間和超聲溫度四個因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,按照Box-Behnken試驗設(shè)計因素和水平,以總酚和總黃酮提取量為指標(biāo)通過響應(yīng)面分析確定最優(yōu)提取條件。如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素水平Table 1 The factor levels of Box-Behnken design

1.2.5 多酚含量測定 參考文獻(xiàn)[10],在760 nm處測量吸光度值。以沒食子酸對照品的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=91.25X-0.0055,R2=0.9996。結(jié)果以每克無花果干果中含有相當(dāng)于沒食子酸毫克數(shù)表示,單位為mg/g。

1.2.6 總黃酮含量測定 參考文獻(xiàn)[11],在510 nm處測量吸光度值。以蘆丁對照品的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=4.8749X+0.0218,R2=0.9983。結(jié)果以每克無花果干果中含有相當(dāng)于蘆丁毫克數(shù)表示,單位為mg/g。

1.2.7 抗氧化能力測定

1.2.7.1 還原能力測試 以最佳提取條件下的提取液為原液,參考文獻(xiàn)[12],在700 nm處測定吸光度值。以VC做對照試驗,重復(fù)測量求平均值,吸光度越高,則還原能力越強(qiáng)。

1.2.7.2 羥自由基清除率測定以最佳提取條件下的提取液為原液,參考文獻(xiàn)[13],在510 nm處測樣品及對照品VC的羥自由基清除能力,結(jié)果如:

式中:A1為空白對照組吸光度(蒸餾水代替待測液);A2為樣品組吸光度;A3為干擾組吸光度(蒸餾水代替水楊酸)。

1.2.7.3 DPPH自由基清除能力測定 以最佳提取條件下的提取液為原液,參考文獻(xiàn)[14],在517 nm處測樣品及對照品VC的DPPH自由基清除能力,結(jié)果如:

式中:A1為樣品組吸光度;A2為干擾組吸光度(無水乙醇代替DPPH);A3為空白組吸光度(無水乙醇代替待測液)。

1.2.7.4 超氧陰離子自由基清除率測定 以最佳提取條件下的提取液為原液,參考文獻(xiàn)[15],在320 nm處測樣品及對照品VC的超氧陰離子自由基清除能力,結(jié)果如:

式中:A0為空白對照組吸光度(蒸餾水代替待測液);A1為樣品組吸光度;A2為干擾實(shí)驗組吸光度(蒸餾水代替鄰苯三酚)。

1.2.8 人工模擬胃腸液處理對無花果提取物抗氧化活性影響 本實(shí)驗進(jìn)行了人工模擬胃腸液的體內(nèi)消化微環(huán)境,為無花果干果黃酮提取物體內(nèi)功能性實(shí)驗提供數(shù)據(jù)指導(dǎo)[16]。參考相關(guān)文獻(xiàn)[17],人工胃液配制方法如下:量取1 mol/L稀鹽酸溶液16.4 mL,加入800 mL蒸餾水,再加入10.0 g胃蛋白酶,混勻后定容至1000 mL。人工腸液配制方法如下:稱取6.8 g的KH2PO4,加入500 mL蒸餾水,用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8,再加入10.0 g胰蛋白酶,定容至1000 mL。

取最優(yōu)條件下無花果干果提取物溶液5 mL(其中黃酮質(zhì)量濃度為5 mg/mL),分別加入到50 mL人工胃液和82.5 mL人工腸液中,其中人工胃液處理組在37 ℃條件下,130 r/min(模擬體內(nèi)胃蠕動)恒溫?fù)u床振蕩70 min,人工腸液處理組在37 ℃條件下,45 r/min(模擬體內(nèi)腸蠕動)恒溫?fù)u床振蕩120 min,以蒸餾水作空白對照,處理結(jié)束后采用100 mL乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并用無水乙醇定容至10 mL[18],進(jìn)行抗氧化活性測定,每組實(shí)驗重復(fù)3次[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗

如圖1a所示,提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)較低時,無花果干果中多酚和總黃酮的提取量也較少,當(dāng)采用60%乙醇進(jìn)行提取時,多酚和總黃酮的提取量均達(dá)到最大值(多酚約為2.53 mg/g,總黃酮約為19.34 mg/g),繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù),提取量反而有所降低。這是因為60%乙醇溶液與無花果酚類和黃酮類物質(zhì)的極性最為接近,作為提取溶劑最為適宜。

圖1 單因素對無花果干果多酚和總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of single factors on the yield of polyphenols and total flavonoids注:a.乙醇體積分?jǐn)?shù);b.料液比;c.超聲時間;d.超聲溫度。

如圖1b所示,料液比較小時,隨著料液比的增加,多酚和總黃酮的提取量也緩慢增加,當(dāng)采用料液比為1∶40乙醇進(jìn)行提取時,多酚和總黃酮提取量達(dá)到最大值(多酚約為2.13 mg/g,總黃酮約為19.29 mg/g),料液比高于1∶40時,提取量反而下降。這是因為隨著提取溶液的增加,多酚和黃酮物質(zhì)得到了充分溶出,在1∶40時達(dá)到最高,之后隨著提取溶液的繼續(xù)增加,實(shí)驗誤差也逐漸變大,同時考慮溶劑用量和能量損耗,選擇料液比為1∶40最為適宜。

如圖1c所示,隨著超聲時間的增加,無花果干果中多酚和總黃酮的提取量也逐漸增加,當(dāng)提取時間為50 min時,多酚和總黃酮提取量均達(dá)到最大值(多酚約為1.84 mg/g,總黃酮約為17.44 mg/g),繼續(xù)增加超聲時間,提取量下降。這是因為隨著提取時間的增加,無花果干果中的多酚和黃酮溶出量增多,在50 min時達(dá)到最高,之后隨著提取時間的繼續(xù)增加在溫度的影響下發(fā)生了分解,導(dǎo)致提取量下降。

如圖1d所示,超聲溫度為50 ℃時,無花果干果中多酚和總黃酮提取量達(dá)到最大值(多酚約為1.87 mg/g,總黃酮約為16.54 mg/g),提取溫度過低時提取量明顯下降,提取溫度升高時提取量也呈下降趨勢。這是因為隨著超聲溫度的升高,分子運(yùn)動速度加快,有利于多酚和黃酮的溶出,但是酚類和黃酮類物質(zhì)在長時間高溫下會受到一定程度的破壞,因此提取量反而下降。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗結(jié)果分析

2.2.1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果 以總酚和總黃酮提取量為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計因素水平編碼[20]。結(jié)果見表2。

表2 超聲波輔助提取干無花果中多酚和總黃酮的響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for the response surface analysis to optimize the ultrasonic assisted extraction of polyphenols and total flavonoids from DriedFigs

2.2.2 多酚回歸方程方差分析及響應(yīng)面試驗結(jié)果 以超聲溫度、超聲時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)作為響應(yīng)變量,以總酚提取量作為響應(yīng)值,建立二次回歸多元方程如下:Y=2.83+0.075A+0.069B+0.12C+0.047D+0.15AB+0.053AC-0.012AD-0.073BC-0.085BD+0.025CD-0.21A2-0.28B2-0.24C2-0.13D2。

表3 多酚提取響應(yīng)面模型方差分析Table 3 Analysis of variance of phenol extraction response surface model

各因素交互作用對多酚提取量影響的響應(yīng)曲面以及等高線如圖2所示。響應(yīng)面圖坡度的陡峭程度直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響,兩兩因素間均有交互作用,其中超聲溫度和超聲時間交互作用最強(qiáng),表現(xiàn)為所對應(yīng)的響應(yīng)曲面變化較為陡峭;超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用最弱,表現(xiàn)為所對應(yīng)的的響應(yīng)曲面較為平緩。

圖2 各因素交互作用影響多酚提取量的響應(yīng)面圖Fig.2 Interaction effect of each factor affects the response surface of polyphenol extraction

2.2.3 總黃酮回歸方程方差分析及響應(yīng)面試驗結(jié)果 以超聲溫度、超聲時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)作為響應(yīng)變量,以總黃酮提取量作為響應(yīng)值,建立二次回歸多元方程如下:Y=21.83+0.071A+0.33B+0.043C+0.15D+0.39AB+0.67AC+0.020AD+0.29BC-0.10BD-0.18CD-0.67A2-1.78B2-1.37C2-0.74D2。

表4 總黃酮提取響應(yīng)面模型方差分析Table 4 Analysis of variance of total flavonoids extraction response surface model

各因素交互作用對黃酮提取量影響的響應(yīng)曲面以及等高線如圖3所示。響應(yīng)面圖坡度的陡峭程度直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響,兩兩因素間均有交互作用,其中超聲溫度和超聲時間,超聲時間和料液比,超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)以及料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用均較強(qiáng),表現(xiàn)為所對應(yīng)的響應(yīng)曲面變化較為陡峭;超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用最弱,表現(xiàn)為所對應(yīng)的的響應(yīng)曲面較為平緩。

圖3 各因素交互作用影響總黃酮提取量的響應(yīng)面圖Fig.3 Interaction effect of each factor affects the response surface of flavonoid extraction

通過對回歸方程式求解,使總酚和總黃酮提取量取最大值得到最優(yōu)結(jié)果一致,為超聲時間52.56 min,超聲溫度51.42 ℃,料液比1∶46.8,乙醇體積分?jǐn)?shù)61.11%。在此條件下,最大多酚提取量2.86 mg/g,最大黃酮提取量21.93 mg/g;考慮到實(shí)驗室條件,確定最佳提取條件為超聲時間52 min,超聲溫度51 ℃,料液比1∶45,乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,在此工藝條件下,進(jìn)行三次平行實(shí)驗,得到多酚提取量為(2.72±0.37) mg/g,黃酮提取量為(20.89±0.57) mg/g。

2.3 無花果干果提取物抗氧化活性比較

2.3.1 多酚提取物抗氧化活性比較 在最佳提取條件下得到無花果干果提取液,計算多酚質(zhì)量濃度,配制成與VC濃度相同的待測液。進(jìn)一步比較無花果干果多酚提取物和VC的還原能力、羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力,結(jié)果如圖4所示。

圖4 無花果干果多酚提取物還原能力(a)、羥自由基(b)、DPPH自由基(c)、超氧陰離子自由基(d)清除能力Fig.4 Total reducing power,hydroxyl,DPPH and super-oxide anion free radical scavenging abilities of polyphenols

由圖4可知,無花果干果提取出的多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力,且隨著質(zhì)量濃度的升高而呈遞增的趨勢。在相同梯度質(zhì)量濃度條件下,無花果干果中多酚的還原能力,羥自由基和DPPH自由基清除能力均高于VC,原因可能是無花果中的酚類物質(zhì)在提取和干燥過程中得到了濃縮導(dǎo)致含量或活性的增強(qiáng)[21],或多酚提取物中含有其他抗氧化能力較高的物質(zhì),致使其抗氧化能力大大提升;但是對超氧陰離子自由基的清除能力較差,分析原因可能是提取液中其他物質(zhì)對清除超氧陰離子自由基的拮抗作用。Dewanto 等[22]認(rèn)為酚類物質(zhì)常與細(xì)胞壁上的物質(zhì)以結(jié)合的方式存在,熱加工、巴氏殺菌以及冷凍干燥法等可以使酚類物質(zhì)從結(jié)合態(tài)釋放出來,導(dǎo)致酚類物質(zhì)的增加或減少;還有可能是干燥過程中酚類物質(zhì)發(fā)生熱分解、被氧化、以及在酶的作用下轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)或由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酚類物質(zhì),導(dǎo)致其含量的變化[23]。

2.3.2 黃酮提取物抗氧化活性比較 在最佳提取條件下得到無花果干果提取液,計算黃酮質(zhì)量濃度,配制成與VC濃度相同的待測液,進(jìn)一步比較無花果干果黃酮提取物和VC的還原能力,清除羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基率,結(jié)果如圖5所示。

圖5 無花果干果黃酮提取物還原能力(a)、羥自由基(b)、DPPH自由基(c)、超氧陰離子自由基(d)清除能力Fig.5 Total reducing power,hydroxyl、DPPH and super-oxide anion free radical scavenging abilities of flavonoids

由圖5可知,無花果干果黃酮提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力,且隨著質(zhì)量濃度的升高而呈遞增的趨勢。在相同梯度質(zhì)量濃度條件下,無花果黃酮提取物的各抗氧化能力均低于VC。其中,無花果黃酮提取物溶液與VC的還原能力和羥自由基清除能力變化趨勢相似,隨著濃度的增加呈上升趨勢,而超氧陰離子自由基清除能力隨質(zhì)量濃度的變化幅度較小,低于同濃度的VC。分析原因可能是VC自身的抗氧化能力較高,無花果干果提取液中的黃酮類化合物與其他物質(zhì)之間的相互作用,導(dǎo)致抗氧化能力低于VC。

2.4 人工模擬胃腸液處理對無花果干果提取物抗氧化能力影響

經(jīng)過人工胃腸液處理后,無花果干果提取物的抗氧化能力如表5所示。

表5 人工胃腸液處理對無花果干果提取物抗氧化能力影響Table 5 Effect of artificial gastrointestinal treatment on antioxidant activities of drsedFigs extrocts

由表4可知,經(jīng)由人工胃液處理以后,提取液的還原能力和羥自由基清除能力顯著或極顯著升高(p<0.05或p<0.01),而DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力極顯著降低(p<0.01),而經(jīng)過人工腸液處理后,相應(yīng)的還原能力和超氧陰離子自由基清除能力顯著或極顯著提高(p<0.05或p<0.01),而DPPH和羥自由基清除能力極顯著下降(p<0.01)。推測可能是由于無花果提取物中具有明顯抗氧化活性的黃酮類化合物在模擬胃腸液處理條件下其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了不同的變化,從而導(dǎo)致其活性發(fā)生變化。Kamiloglu等[24]認(rèn)為可能是由于體系中存在的抑制物或輔助因子對黃酮化合物的活性產(chǎn)生了抑制或促進(jìn)作用。本研究中無花果黃酮為一種粗提物,因此還需進(jìn)一步對粗品進(jìn)行純化,并進(jìn)行更深入的探討。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化無花果干果多酚和黃酮得到最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,超聲溫度51 ℃,超聲時間52 min,料液比1∶45。在此工藝條件下的多酚提取量為(2.72±0.37) mg/g,黃酮提取量為(20.89±0.57) mg/g。體外抗氧化實(shí)驗表明,在相同質(zhì)量濃度下,無花果干果中多酚提取物的還原能力、羥自由基清除能力以及DPPH自由基清除能力均高于VC;而黃酮提取物各抗氧化能力均低于VC。模擬胃腸液處理的抗氧化結(jié)果表明,經(jīng)過人工胃腸液處理后,無花果黃酮的抗氧化能力發(fā)生了明顯變化，推斷其與處理后活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能變化有關(guān)。