冷藏小黃魚優勢腐敗菌致腐能力評價 及其對揮發性成分的影響

黃佳奇,葛雨珺,向迎春,余海霞,楊水兵,胡亞芹,,*

(1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058; 2.浙江大學舟山海洋研究中心,浙江舟山 316021)

小黃魚是中國四大海產品之一,作為一種高蛋白低脂肪食物受到廣大消費者的青睞,根據漁業年鑒,2014～2017年,其產量均維持在35萬噸上下,但自然捕撈上來的小黃魚經過劇烈掙扎,很大一部分帶有明顯的機械損傷,魚鰓和內臟處粘液是天然的微生物培養基,很容易滋生多種腐敗微生物和病原菌體型,而小黃魚體型較小,比表面積大,更容易受微生物污染而腐敗變質。據估計,每年有高達25%的水產品在捕獲后由于腐敗微生物作用而被迫丟棄[1],因其而產生的小黃魚經濟損失在10～20億元人民幣。因此,采用合適的方法抑制微生物的代謝活動對保持小黃魚的品質至關重要。

優勢腐敗菌是指貯藏初期數量和種類并不占明顯優勢,但隨著貯藏時間的延長而大量繁殖的腐敗微生物[2]。優勢腐敗菌將肌肉組織中的蛋白質、氨基酸及其它含氮物質分解成揮發性胺類和硫化物等,使水產品散發出具有腐敗特征的臭味,如腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaction)侵染大黃魚會使其產生強烈的腐臭味,嚴重影響其感官品質[3]。目前有關小黃魚優勢腐敗菌的研究非常少。

在水產品新鮮度的感官評價中,氣味所占的比例往往高于其他指標,達到30%以上[4-5]。不同類型的優勢腐敗菌由于其代謝方式的不同,產生的腐敗揮發性成分種類和含量也有較大的差異[6]。現在有關優勢腐敗菌致腐能力的評價很大部分以揮發性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)為主,存在一定的片面性。

本課題以小黃魚及其優勢腐敗菌為原料,探究4 ℃冷藏小黃魚的優勢腐敗菌種類及其對腐敗揮發性成分的影響,并探究全面評價優勢腐敗菌致腐能力的指標,為后期建立優勢腐敗菌生長模型、靶向抑菌和小黃魚質量快速檢測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

舟山小黃魚(70～90 g/尾) 取自浙江省舟山市沈家門碼頭,選取的小黃魚外形完整,色澤明亮,無機械損傷,用泡沫箱碎冰包裝并在5 h內運輸至杭州;變形桿菌屬(Proteushauseri,P.hauseri)、普羅威斯登菌屬(Providenciaheimbachae,P.heimbachae)、希瓦氏菌屬(Shewanellaglacialipiscicola,S.glacialipiscicola) 實驗室自分離優勢腐敗菌,保存于-80 ℃;大豆酪蛋白瓊脂培養基(Soybean-Casein Digest Agar Medium,TSA)、假單胞CFC選擇性培養基(Pseudomonas CFC Selective Agar,CFC)、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(Violet Red Bile Glucose Ager,VRBGA) 青島海博生物技術有限公司;環己酮 色譜純,阿拉丁試劑有限公司;高純氦氣(>99.9%) 杭州今工特種氣體有限公司。

SW-CJ-1FD型超凈臺 南京蘇凈安泰空氣技術有限公司;I Mix型均質機 法國InterLab有限公司;5418R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司;K9860型全自動凱氏定氮儀 山東海能儀器有限公司;固相微萃取(solid-phase micro-extraction,SPME)DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司;DB-5毛細管色譜柱(30 m×250 μm,0.25 μm) 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌魚塊制備 參考Herbert等[7]的方法并稍作改動。4 ℃解凍小黃魚后,去頭、尾、鱗、內臟后清洗,在無菌超凈臺中將小黃魚塊放在滅菌的砧板上,并切成約2 cm×1 cm×0.5 cm的魚塊,在75%的乙醇中浸泡10 s后撈起自然揮發,并用無菌蒸餾水再次清洗,使魚體表面菌落數小于2 lg CFU/g。

1.2.2 菌懸液制備 單菌液的制備參考李學英等[8]的方法并稍作改動。將先前冷凍保藏的3株冷藏小黃魚優勢腐敗菌凍存液在37 ℃水浴中活化15 min,并在營養瓊脂中劃線培養復壯后,將變形桿菌屬Proteushauseri于VRBGA培養基中劃線37 ℃培養、普羅威斯登菌屬Providenciaheimbachae于VRBGA培養基中劃線37 ℃培養、希瓦氏菌屬Shewanellaglacialipiscicola于CFC培養基中劃線37 ℃培養。挑取典型單菌落于50 mL營養肉湯中,37 ℃下培養12 h,4000 r/min離心后棄上清液,并用無菌生理鹽水調整細菌懸液濃度至6～6.5lg CFU/g范圍。

1.2.3 單優勢腐敗菌接種 將上述制備的無菌魚塊及單菌菌懸液置于超凈臺中。將小黃魚塊浸泡于稀釋菌液中,10 s后取出,放置于無菌培養皿中,每個菌株接種30個小黃魚塊,以無菌小黃魚塊作對照,4 ℃冰箱保存。

1.2.4 菌落總數測定 菌落總數測定參考GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[9]。取小黃魚肉5.00 g于無菌均質袋中,加入45 mL生理鹽水后用均質器拍打3 min,制備1∶10 (g∶mL)樣品勻液,并依次做10倍梯度稀釋。取1 mL適宜稀釋度的樣品稀釋液,用相應的培養基傾注混勻,于37 ℃培養24 h,每個稀釋度3組平行。

1.2.5 TVB-N值測定 TVB-N值測定參考唐文靜等[10]的方法并稍做改動。取3.00 g小黃魚塊于50 mL離心管中,加入27 mL,0.6 mol/L HClO4溶液,冰浴下勻漿1 min,4000 r/min離心10 min,取10 mL上清液于全自動凱氏定氮儀內測定,每個樣品做3組平行。

1.2.6 致腐能力測定 參考李學英等[8]的方法,以產量因子YTVB-N/CFU為指標,即以冷藏小黃魚感官評價終點時單位優勢腐敗菌產生的腐敗代謝產物的量為腐敗菌腐敗能力指標,計算公式如下。

式中,Ns、N0分別為初始菌落數和感官終點時的菌落數(CFU/g);(TVB-N)s、(TVB-N)0分別為貨架期初始點及終點的TVB-N含量(mg N/100 g)。

1.2.7 SPME及GC-MS分析 參考劉源等[11]和Mik?krajnik等[5]的方法并做適當修改。稱取2.00 g樣品于15 mL萃取小瓶中,加入5 mL飽和氯化鈉溶液及20 μg/mL環己酮溶液。55 ℃條件下水浴平衡10 min后將經老化的SPME頭插入封口頂空采樣,吸附30 min后拔出并再將萃取針頭插入氣相色譜儀進樣口,250 ℃條件下解析3 min。

參考汪倩等[12]的方法并做適當修改。以DB-5柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)為毛細管柱,以高純氦氣為載氣,恒定流速為1.2 mL/min。升溫程序為起始溫度40 ℃,保持5 min,以5 ℃/min速率升到160 ℃,保持5 min,再以10 ℃/min的速率升到250 ℃,保持5 min。進樣口溫度為250 ℃。以全掃描模式采集信號,電子轟擊能量為70 eV;接口溫度為270 ℃,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,掃描質量范圍45.00～500.00 u,掃描頻率3.47/s。

1.3 數據處理

使用SPSS 22.0和Excel 2013軟件進行方差分析,以p<0.05表示差異顯著;GC-MS數據對照已知的環己酮含量及其峰面積計算得到,以μg/g為單位。

2 結果與分析

2.1 菌落總數和TVB-N值的變化

4 ℃貯藏下定期取樣測定菌落總數如圖1所示,初期接種濃度為6～6.5lg CFU/g,期間各腐敗菌呈現出類似的增長趨勢,貯藏前2 d菌落總數維持在恒定的水平,一方面可能無菌魚塊有殘留酒精,另一方面可能是微生物的停滯期[13],即初始微生物在37 ℃下的肉湯中擴增培養,而接種后需要時間來適應較低的環境溫度和不同的營養介質。第2～8 d菌落總數呈現快速增長,到第8 d之后增速放緩,最后均趨向于9lg CFU/g水平。

圖1 3種優勢腐敗菌接種魚塊菌落總數隨貯藏時間的變化Fig.1 Changes of total viable counts of 3 kinds of SSOs

各優勢腐敗菌影響下冷藏小黃魚TVB-N值變化如圖2所示。小黃魚初始TVB-N值為(8.953±2.017) mgN/100 g,并隨貯藏時間逐漸增大,至貯藏后期P.hauseri、P.heimbachae和S.glacialipiscicola接種魚塊分別達到(88.383±7.752)、(75.173±5.220)和(92.583±7.130) mgN/100 g。貯藏期間TVB-N值與腐敗微生物的生長具有密切關系[14-15],雖然自身酶、冷藏等因素也會影響其值大小,但影響力還遠不到十分可觀的程度[16]。以30 mg N/100 g為水產品的TVB-N值上限,在貯藏第4d時,所有接種優勢腐敗菌的小黃魚魚塊均達到腐敗,表明3種菌株都有著較強的致腐能力。不同水產品TVB-N值變化與優勢腐敗菌也密切相關,唐文靜等[17]發現4 ℃冷藏海鱸魚在接種腐敗希瓦氏菌后在貯藏第8 d的TVB-N值超過100 mg N/100 g,而徐振偉等[18]發現在接種腐敗希瓦氏菌后冷藏鯉魚和羅非魚在貯藏第8 d的TVB-N值僅為50 mg N/100 g。

圖2 3種優勢腐敗菌接種魚塊TVB-N隨貯藏時間的變化Fig.2 Changes of TVB-N values inoculated by 3 kinds of SSOs

2.2 TVB-N產量因子分析

不同腐敗菌利用分解蛋白質產生的代謝物不同,引起肉品腐敗的程度和特性也不同,由此可反映不同優勢腐敗菌致腐能力的差異[19]。以TVB-N產量因子作為優勢腐敗菌致腐能力的定量分析指標,結果見表1。P.hauseri和S.glacialipiscicola的YTVB-N/CFU值相仿,P.heimbachae的YTVB-N/CFU值要小于其它兩株優勢腐敗菌。

表1 3種優勢腐敗菌的TVB-N產量因子Table 1 Yield factors of TVB-N of specific spoilage organisms

綜上，通過YTVB-N/CFU得出冷藏小黃魚優勢腐敗菌致腐能力最強的為P.hauseri和S.glacialipiscicola,P.heimbachae較弱。本實驗各優勢腐敗菌YTVB-N/CFU值與之前的研究在同一數量水平,劉愛芳等[20]測定的冷藏金槍魚各優勢腐敗菌YTVB-N/CFU差異為298%,徐振偉等[18]測定的冷藏鯉魚和羅非魚各優勢腐敗菌YTVB-N/CFU差異為394%,本實驗3株優勢腐敗菌致腐能力差異在36%以內,與先前感官評價初篩一輪腐敗菌有關。

2.3 GC-MS分析

頂空SPME是利用萃取針內部纖維提取濃縮揮發性成分,隨后將吸附的氣體解析進入GS-MS儀,可以對氣味產生物質進行定性和定量分析[21]。從P. hauseri接種黃魚塊中累計分離鑒定出40種揮發性成分,P. heimbachae 39種,S. glacialipiscicola 37種,各類揮發性成分總含量變化如圖3所示。

圖3 3種優勢腐敗菌接種魚塊各類揮發性成分變化情況Fig.3 Changes of volatile organic compounds produced by specific spoilage organisms注:a:P. hauseri;b:P. heimbachae;c:S. glacialipiscicola;d:對照。

從圖3中可以看到接菌魚塊的揮發性成分主要為醇類、醛酮類、酯類、烴類、含氮含硫物和其它含苯揮發物。初始貯藏時,魚塊的揮發物總含量為(37.164±7.060) μg/g,以烴類為主,約占揮發物總量的70%。至貯藏第10 d,P.hauseri,P.heimbachae和S.glacialipiscicola接種魚塊的揮發物總含量分別為(280.913±55.652)、(218.548±33.952)和(301.835±59.450) μg/g,以醇類、酯類為主。醇類的產生途徑包括氨基酸代謝、甲基酮的還原、多不飽和脂肪酸過氧化及醛類的還原等[22-23],3種腐敗菌接種魚塊醇類含量呈穩步上升趨勢,至第10 d均介于50～70 μg/g范圍,醇類氣味閾值較高,對氣味的貢獻度較小。醛酮類主要來源于脂肪氧化及氨基酸轉氨作用等[24],3種腐敗菌接種魚塊的醛種類較少,且貯藏期間總含量均在10 μg/g以下,由于醛類普遍含量較低,且在貯藏期間極易氧化成酸類,因此多數情況下很難與腐敗菌進行很好的關聯[25]。3種優勢腐敗菌接種魚塊的揮發性成分中,酯類的種類最多,所占比例最大,濃度變化幅度最大。從P.hauseri接種魚塊中檢測到15種酯類,P.heimbachae17種,S.glacialipiscicola14種,貯藏第10d總含量分別為(72.680±12.807),(95.485±16.335)和(117.399±22.746) μg/g,有研究報道顯示單菌接種肉類更易產生酯類化合物,且其含量占主導地位[26],而在自然腐敗下,酯類產生量相對較少。總體而言酯類物質雖然含量高,但對氣味的貢獻度不大,且多數情況下感官感受偏向積極。烴類主要為C10到C19的中鏈烷烴,且接菌魚塊和無菌魚塊烴類總含量隨貯藏時間均維持在20～40 μg/g范圍內,目前普遍的觀點是烴類產生源于食品自身的理化變化,而非微生物的作用[25]。苯及其衍生物的含量很大程度上與小黃魚的食物來源有關[27],個體差異較為顯著。

含硫化合物和含氮化合物通常具有極低的氣味閾值低,是腐臭味的主要來源。兩種含硫化合物在P.hauseri、P.heimbachae和S.glacialipiscicola貯藏第10 d接種魚塊總含量分別達到(5.503±1.135)、(2.058±0.353)和(12.386±3.07) μg/g。含硫化合物主要來自含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)的分解,此次研究中發現的二甲基二硫和二甲基三硫出現在腐敗菌接種第4 d后,雖然含量維持在較低的水平,但較低的氣味閾值使得這兩種含硫化合物具有硫磺味和洋蔥刺激味[28],兩種含硫化合物也是大黃魚的特征腐敗揮發物[29],表明分解含硫氨基酸能力方面S.glacialipiscicola最強,P.hauseri次之,P.heimbachae最弱,希瓦氏菌屬較強的致腐能力體現之一即為能高效分解含硫氨基酸釋放揮發性硫[30],因此S.glacialipiscicola接種魚塊的含硫揮發物含量遠遠高于其它兩組接種魚塊。含氮化合物主要為吲哚和三甲胺,屬于特征腐敗揮發物,在豬肉[31]、三文魚[5]等腐敗過程中均有報道,在3種優勢腐敗菌接種下這兩種物質含量隨貯藏時間發生顯著的升高。吲哚在P.hauseri、P.heimbachae和S.glacialipiscicola貯藏第10 d接種魚塊中的含量分別達到(37.448±6.905)、(15.718±2.737)和(47.228±8.571) μg/g,吲哚由色氨酸酶以5′-磷酸吡哆醛為輔酶催化L-色氨酸產生,吲哚的產生受內源酶和外在環境的雙重影響,溫度、pH、胞外色氨酸水平等環境因子影響色氨酸酶的活性[32],因此相同條件下P.hauseri和S.glacialipiscicola的色氨酸酶活性要顯著強于P.heimbachae,與產量因子計算結果一致。三甲胺在P.hauseri、P.heimbachae和S.glacialipiscicola貯藏第10 d接種魚塊中的含量分別達到(13.903±3.851)、(6.930±1.181)和(12.881±3.334) μg/g,氧化三甲胺是體現海產品特色鮮味成分物質,魚體死亡后體內氧化三甲胺經微生物氧化三甲胺還原酶還原得到三甲胺,是腐敗惡臭成分之一。氧化三甲胺還原酶在多種海洋細菌和腸道細菌中被發現,S.glacialipiscicola為典型的海洋細菌,而P.hauseri和P.heimbachae為典型的腸桿菌,但酶活存在較大差異,相同條件下P.hauseri和S.glacialipiscicola的氧化三甲胺還原酶活性顯著強于P.heimbachae,也與產量因子計算結果一致。綜上所述,在腐敗味貢獻方面,S.glacialipiscicola最強,P.hauseri次之,P.heimbachae最弱。

苯酚主要的來源為含苯氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)的降解,在豬肉、牛肉和草魚中都作為腐敗特征性揮發物[33-35],但其對腐敗氣味的貢獻度不大,苯酚在P.hauseri接種魚塊中沒有檢測到,在P.heimbachae接種魚塊中含量較低,貯藏期間含量在1～6 μg/g范圍,而在S.glacialipiscicola接種魚塊中含量逐漸上升,至第10 d達到(17.947±2.227) μg/g,表明在分解芳香族氨基酸方面S.glacialipiscicola要顯著強于P.heimbachae(p<0.05)。

2.4 TVB-N與揮發性成分相關性分析

腐敗代謝產物,如TMA、TVB-N、組胺等其它與腐敗有關的代謝產物,其產量因子可作為評價肉類腐敗菌腐敗能力的定量指標[3,36]。以TVB-N值為參考指標,將各優勢腐敗菌接種下小黃魚含氮含硫揮發物與對應的TVB-N值做相關性分析,結果如表2至表4所示。P.hauseri接種下冷藏小黃魚的三甲胺含量、二甲基二硫含量和二甲基三硫含量與TVB-N值呈極顯著相關(p<0.01),而吲哚含量與TVB-N值呈顯著相關(p<0.05);P.heimbachae接種下冷藏小黃魚的吲哚含量、三甲胺含量和二甲基二硫含量與TVB-N值呈極顯著相關(p<0.01);S.glacialipiscicola接種下冷藏小黃魚的三甲胺含量、二甲基二硫含量和二甲基三硫含量與TVB-N值呈極顯著相關(p<0.01),而吲哚含量與TVB-N值呈顯著相關(p<0.05),表明吲哚、三甲胺、二甲基二硫和二甲基三硫作為腐敗有關代謝產物可以很好地反應出小黃魚的新鮮度,理論上可以代替TVB-N值進行優勢腐敗菌致腐能力的評價。本研究中,優勢腐敗菌接種魚塊的氣味物質含量有著較大的差異,如以含硫物質作為致腐能力評價指標,主要表明優勢腐敗菌在分解含硫氨基酸能力的差異,TVB-N值作為一個綜合性腐敗化學指標,更多的表明優勢腐敗菌綜合性的致腐能力,而兩者配合能更加全面和深入地反映優勢腐敗菌的致腐能力。

表2 P. hauseri接種魚塊TVB-N值與揮發性成分的相關性系數Table 2 Correlation coefficient of TVB-N value and VOC of little yellow fish inoculated by strain P. hauseri

表3 P. heimbachae接種魚塊TVB-N值與揮發性成分的相關性系數Table 3 Correlation coefficient of TVB-N value and VOC of little yellow fish inoculated by strain P. heimbachae

表4 S.glacialipiscicola接種魚塊TVB-N值與揮發性成分的相關性系數Table 4 Correlation coefficient of TVB-N value and VOC of little yellow fish inoculated by strain S.glacialipiscicola

3 結論

產量因子計算結果表明變形桿菌屬P.hauseri和希瓦氏菌屬S.glacialipiscicola致腐能力相當,普羅威斯登菌屬P.heimbachae略遜。揮發性成分結果顯示3種優勢腐敗菌產生的氣味物質主要為吲哚、三甲胺、二甲基二硫和二甲基三硫,S.glacialipiscicola產生的氣味物質的總量大于P.hauseri大于P.heimbachae。進一步分析發現氣味物質含量變化與對應的TVB-N值呈顯著相關,一方面可比TVB-N值更全面地衡量優勢腐敗菌的致腐能力,另一方面通過建立TVB-N值與這些腐敗揮發物的聯系,可直接利用生物傳感器檢測揮發性成分中的這些特征揮發物,進而可實現水產品工業中的小黃魚新鮮度的快速質量控制[5]。