豬背最長肌蛋白質 在冷凍貯藏過程中的變化

李 靖,馬 嫄,*,岳文婷,袁乙平,蔣珍菊

(1.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039; 2.西華大學西華學院,四川成都 610039; 3.西華大學理學院,四川成都 610039)

我國作為肉類消費大國,豬肉在居民膳食結構中占據著很大的比重[1],每年人均豬肉消費量占肉類總消費量的50%以上。肉的組成結構、質構及很多加工特性都是通過蛋白質來實現的[2],在冷凍保藏過程中蛋白質的變化會直接影響肉的營養水平和加工特性[3]。肌原纖維蛋白作為肌肉中含量最多的蛋白,對外界環境變化敏感,如水分凍結、鹽濃度變化等都會導致其結構的變化,并最終影響肉的品質。目前關于肉在凍藏過程中變化的研究大多集中于不同冷凍方式、冷凍溫度等冷凍條件對肉品質以及加工特性等的影響[4-6],主要關注解凍損失、蒸煮損失、質構、蛋白流失率等方面[7],關于不同凍藏時間對肉中蛋白質特性變化的研究較少。

豬背最長肌作為骨骼肌的一種,其肌纖維在豬的生長發育過程中呈現明顯的發育性變化規律[8],且加工中多用其作為主要原料進行生產。故本文以豬背最長肌為研究對象,探究其在不同凍藏時間后解凍,肉中蛋白質的變化情況,包括蛋白質溶解度、肌原纖維蛋白的表面疏水性變化和降解,以及蛋白質的熱穩定性變化,為豬肉的凍藏條件優化及不同凍藏時間肉的品質評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬背最長肌 購自本地農貿市場,大約克夏豬,宰殺前重量約100 kg,宰殺后于4 ℃冷卻12 h;氯化鈉、氯化鎂、EGTA、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、Tris-HCl、EDTA、氯化鉀、氫氧化鈉、硫酸銅 成都市科龍化工有限公司,均為分析純;8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽(ANS)、二-硫代二硝基苯甲酸(DTNB) 美國Sigma公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液 美國Solarbio公司;蛋白標準Marker 6.5～200 kDa 日本Takara公司。

BCD-649WE型冰箱 青島海爾科技有限公司;MJ-BL25C4型攪拌機 美的公司;Heraeus multifugeX1R型冷凍離心機 德國Thermo Fisher公司;spectraMax i3x型酶標儀 美國Molecular Devices公司;DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠;DSC1型差示掃描量熱儀 瑞士,梅特勒-托利多公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬背最長肌的處理 將豬背最長肌剔除表面筋膜、脂肪等組織,平行于肌纖維方向切分,每塊100 g左右。而后將肉鋪平,利用保鮮袋將其包裹完整,置于-18 ℃冰箱凍制24 h后轉移至冷庫長期凍藏,凍藏溫度-18 ℃。凍藏時間分別為:0 d和1、3、6、9、12、15個月,而后將肉樣取出,于4 ℃解凍24 h,測定相關指標(凍藏0 d的肉樣即將肉樣放于-18 ℃冰箱凍制24 h后取出于4 ℃立即解凍進行各指標的測定)。

1.2.2 蛋白質溶解度的測定 參考牛力[9]的方法,取1 g樣品切碎,加入0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(含1.1 mol/L的碘化鉀,pH=7.2),攪拌30 min,于4 ℃保存20 h,2600×g離心30 min,取上清液1 mL,利用雙縮脲法測定蛋白質濃度,以牛血清蛋白做標準曲線,得到的標準曲線公式為:y=0.0364x-0.0002,R2=0.9996,其中y為吸光度,x為蛋白質溶解度。

1.2.3 豬背最長肌肌原纖維蛋白(Myofibrillar protein isolate,MPI)的提取 取不同凍制時間的肉樣采用honikel袋法[10]于4 ℃冰箱解凍24 h,將解凍后的肉樣利用4倍緩沖液(0.1 mol/L NaCl,2 mmol/L MgCl,1 mmol/L EGTA,10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4,pH=7.0)勻漿后離心(4 ℃,2000×g,15 min),重復四次,第三次離心前利用0.1 mol/L NaCl洗滌勻漿,第四次離心前利用四層紗布過濾去筋膜,濾液調pH至6.0,沉淀,離心(4 ℃,2000×g,20 min),得到的蛋白膏即為豬背最長肌肌原纖維蛋白[4,11]。采用雙縮脲法測定蛋白膏中的蛋白質濃度。

1.2.3.1 MPI表面疏水性的測定 將MPI利用蛋白質緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl 含0.6 mol/L KCl)從0.02～0.12 mg/mL稀釋成若干梯度,而后將4 mL蛋白質稀釋液+50 μL ANS溶液(利用0.1 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4,pH=7.0 緩沖液配制成8 mmol/L的ANS溶液)室溫下反應15 min,利用酶標儀測定熒光強度,激發波長390 nm,吸收波長470 nm,梯度濃度溶液的熒光強度斜率即為蛋白質的表面疏水性[10-11]。

1.2.4 MPI的SDS-PAGE分析 利用1.2.3.1中蛋白質緩沖液將MPI稀釋至10 mg/mL,取4 mL蛋白稀釋液按照4∶1加入1 mL的5×Buffer,3000 r/min常溫離心2 min,沸水浴6 min,冷卻至常溫后,3000 r/min常溫離心2 min,-30 ℃以下保存。電泳用分離膠濃度為12%,采用恒流23 mA進行電泳分離。用0.5 g/L的考馬斯亮藍R250染色2～3 h,然后脫色至背景透明,照相并分析電泳條帶[13]。

1.2.5 豬背最長肌的熱力學性質測定 將不同凍藏時間的豬背最長肌樣品于4 ℃解凍24 h后送至四川大學分析測試中心進行差示量熱掃描(DSC)測定。測定條件:在30 ℃條件下,以3 ℃/min升到100 ℃,利用儀器自帶的軟件對熱流變化曲線進行分析,計算樣品變性溫度、熱變性焓值[14]。

1.3 數據處理與分析

實驗數據采用SPSS 15.0進行方差分析(one way ANOVA)、顯著性分析,不同顯著性數據用不同字母進行標記,利用Originlab 8.0進行圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 豬背最長肌蛋白質溶解度的變化

由圖1可知,在15個月的凍藏過程中,豬背最長肌中的蛋白質溶解度呈現逐漸降低的趨勢。在凍藏的前3個月內,蛋白質溶解度盡管有所下降,但維持在200 mg/g以上,其中凍藏1個月和3個月的肉樣蛋白質溶解度由于凍藏時間較短,而且間隔的時間不長,凍藏對蛋白的破壞程度較低,因此差異不顯著。隨著凍藏時間的延長,蛋白質溶解度下降速率加快。凍藏12個月后,與初始相比較,其溶解度下降了56%,凍藏15個月時,蛋白質溶解度已下降到65.27 mg/g,僅為初始值的1/4左右,差異極顯著(p<0.01)。這是由于鹽析作用、細胞內外溶液濃度的變化以及膠體結合水的凍結等一系列作用導致蛋白質的變性[2,15],如蛋白質疏水結構、巰基,進而引起蛋白質功能性的變化[16]。蛋白質溶解度的降低是肌肉品質下降的重要指標,因為肌肉蛋白質的功能特性只有在蛋白質處于高溶解狀態下才能表現出來。

圖1 豬背最長肌在15個月凍藏期內蛋白質溶解度的變化Fig.1 Change of protein solubility in pork longissimus dorsi during 15 months of frozen storage注：不同字母表示差異顯著(p<0.05);圖2、圖3同。

2.2 MPI表面疏水性的變化

由圖2可知,在15個月的凍藏期內,豬背最長肌肌原纖維蛋白的表面疏水性(梯度濃度溶液的熒光強度斜率即為蛋白質的表面疏水性)呈現逐漸變大的趨勢。在前3個月的凍藏期,MPI的表面疏水性變化較小,維持在3000左右;隨著凍藏時間的延長,從第6月開始,表面疏水性逐漸增加;在凍藏15個月后,表面疏水性達到了7007.48,表明在凍藏過程中蛋白質的結構已經發生了一定程度的改變[17]。因為在凍藏過程中由于持續的凍結和細胞內鹽濃度的增加,肌原纖維蛋白疏水性區域內的氨基酸側鏈疏水性殘基暴露出來,蛋白質對水分的束縛作用減小,蛋白質之間的氫鍵作用、疏水結構發生改變[18-19]。

圖2 豬背最長肌MPI在15個月 凍藏期內表面疏水性的變化Fig.2 Surface hydrophobicity(So-ANS)of pork longissimus dorsi myofibril protein isolated(MPI)during 15 months of frozen storage

2.3 MPI巰基含量的變化

從圖3可知,MPI的巰基含量隨凍藏時間的延長逐漸增加,前6月的變化較小,從最初的4.476 mol/105g增長到4.809 mol/105g,差異不顯著。但隨著凍藏時間的延長,從第6月開始,巰基含量出現顯著增加(p<0.05),且增長速率逐漸增加,到凍藏15月后,巰基含量達到了7.213 mol/105g。肌球蛋白、肌動蛋白的巰基基團主要埋藏于蛋白質的內部,巰基在維持蛋白質的三級、四級結構上有著重要作用[3],同時也可衡量蛋白質的氧化程度。在凍藏的過程中由于肌原纖維蛋白的降解以及二硫鍵的破壞,導致了蛋白質的巰基含量的上升。同時,MPI的表面疏水性(So-ANS)值升高也反映出了蛋白質結構隨著凍藏時間的延長展開程度不斷增加,從而使得巰基不斷暴露。

圖3 豬背最長肌MPI在15個月凍藏期內巰基含量變化Fig.3 Sulfhydryl(SH)contents of pork longissimus dorsi myofibril protein isolated(MPI)during 15 months of frozen storage

2.4 MPI的SDS-PAGE分析

豬肉肌原纖維蛋白中主要包括肌球蛋白、肌動蛋白、肌聯蛋白、肌鈣蛋白等多種蛋白質。圖4反映了不同凍藏時間豬背最長肌肌原纖維蛋白的降解情況,隨著凍藏時間的延長,位于67 kDa和20～29 kDa附近的蛋白質變化最為明顯,67 kDa為肌動球蛋白(actomyosin)的降解[20],輔肌動蛋白(actinin)和肌動蛋白(actin)的降解在整個凍藏考察期內不明顯,而肌動球蛋白的降解可能與凍藏時間的延長、冰晶體增長、鹽濃度增加有關。

圖4 豬背最長肌MPI在15個月 凍藏期內的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE patterns of pork longissimus dorsi myofibril protein isolated(MPI) during 15 months of frozen storage

2.5 豬背最長肌蛋白質的熱力學性質

從圖5和表1中可知,豬背最長肌中蛋白質有3個特征吸熱峰分別在48～52 ℃、61～64 ℃以及75～77 ℃附近,分別代表:肌球蛋白、肌漿蛋白、肌動蛋白變性引起的吸熱變化[21]。變性溫度反映了蛋白質的穩定性,變性溫度越高,其穩定性也高;變性焓值反映了蛋白質變性程度的大小,其值越大,說明變性程度越小,抗變性能力越強[22]。結果表明:隨著凍藏時間的延長,豬背最長肌肌球蛋白和肌漿蛋白的變性焓值顯著降低(p<0.05),表明這兩類蛋白質的穩定性降低,凍藏時間的增加對蛋白質造成了一定程度的損傷;而肌動蛋白的變性溫度、變性焓值顯著增加(p<0.05),說明肌動蛋白的熱穩定性和抗變性能力較強。冷凍對蛋白質的傷害主要來自兩方面：一是膠體結合水凍結破壞了組織蛋白質的性質,削弱了蛋白質與水之間的親和力,且這種變化是非可逆的,二是水分的凍結引起細胞內汁液中鹽濃度的升高,滲透壓的增加不僅促進了水分的析出,也進一步加速了蛋白的變性[15]。

表1 豬背最長肌在15個月凍藏期內的DSC分析結果Table 1 DSC result of pork longissimus dorsi during 15 months of frozen storage

圖5 豬背最長肌在15個月凍藏期內的DSC圖譜Fig.5 DSC curve of pork longissimus dorsi during 15 months of frozen storage

3 結論

隨著凍藏時間的延長,肌原纖維蛋白的疏水性氨基酸殘基和巰基不斷從蛋白質內部暴露出來,從而使得蛋白質的表面疏水性和巰基含量升高,同時蛋白質溶解度顯著降低(p<0.05),由于肉的許多加工特性都是在蛋白質處于溶解狀態時體現的,因此可以確定肉的加工特性隨著時間的延長也會逐步降低;15個月的凍藏期內,肌球蛋白和肌漿蛋白的熱穩定性降低,而肌動蛋白的抗變性能力較強,發生降解的蛋白質主要是67 kDa的肌動球蛋白以及20～29 kDa范圍內的蛋白質。綜上所述,在凍制的前3個月內蛋白質溶解度、結構變化及熱穩定性等都維持在較好的水平,從第6個月開始,其變化速率加快,變化幅值增加,因此凍藏6月以后背最長肌中蛋白質品質開始加速下降。