GRM4正向別構調節劑抑制乳腺癌細胞的增殖并促進細胞凋亡

李林海，肖 斌，郭梓璇，賴斯華，古麗米熱?安外爾，符玉文，陳建蕓，孫朝暉

1.中國人民解放軍廣州總醫院檢驗科，廣東 廣州 510000；

2.嘉應學院檢驗系，廣東 梅州 514000；

3.廣州醫科大學檢驗系，廣東 廣州 510000

谷氨酸受體是介導谷氨酸生物學作用的重要門控開關，是多種中樞神經系統疾病的治療靶點。谷氨酸受體分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體，其中代謝型谷氨酸受體4（glutamate metabotropic receptor4，GRM4）屬于G蛋白偶聯受體家族，可通過G蛋白介導直接與離子通道偶聯，抑制K+和Ca2+通道開放，K+電導降低，引起緩慢的去極化，增加細胞的興奮性［1］，激活第二信使及下游信號轉導系統。GRM4基因已被定位在EJM1區域內，并代表高級候選基因［2］，是GRM的一員，在離子通道調節、神經元興奮與神經遞質釋放等方面發揮重要作用。近年來，GRM4在腫瘤生物學中的機制研究逐漸被人們關注。研究表明GRM4在結腸癌［3］、前列腺癌［4］及骨肉瘤［5］等多種腫瘤中高表達并與腫瘤患者的預后相關，并且激活GRM4能夠抑制成神經管細胞瘤的增殖能力［6］。但GRM4在乳腺癌中的生物學作用尚不清楚。

正向別構調節劑（positive allosteric modulators，PAM）是結合在別構酶的調節部位并激活該酶催化活性的生物分子，也是研究候選靶蛋白生物學功能的重要工具。近期，Selleck公司推出了兩款GRM4的正向別構調節劑：VU0364439（分子式：C18H13C12N3O3S，相對分子質量：422.29）和VU0364770（C12H9CIN2O，相對分子質量：232.67），作為治療帕金森病、焦慮和疼痛的候選藥物。VU0364439的半最大有效濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）為19.8 nmol/L，是目前為止最強的GRM4正性變構調節劑［7］。VU0364770是一種新研發的特異性的GRM4正向別構調節劑（EC50=1.1 μmol/L）；經測試VU0364770對68種細胞膜受體，包括其他代謝性谷氨酸受體亞型均沒有作用活性［8］。兩種正向別構調節劑均對GRM4有較強的別構激活作用，且具有較好的特異性。

本研究擬分析VU0364439和VU0364770對多種乳腺癌細胞系增殖及凋亡的影響，為探索以GRM4為靶點的新的乳腺癌治療方案提供思路。

1 材料和方法

1.1 細胞培養與實驗試劑

人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、BT474、HCC1937、MDA-MB-453和人正常乳腺癌上皮細胞MCF-10A均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；細胞用DMEM培養基培養，在37 ℃、CO2體積分數為5%的培養溫箱中生長。VU0364439（Cat：S8035，CAS：1246086-78-1，10 mmol/L溶于1 mL DMSO）和VU0364770（Cat：S2862，CAS：61350-00-3，10 mmol/L溶于1 mL DMSO）購自美國Selleck公司（圖1）；CellTiter-Glo?細胞活性檢測試劑購自美國Promega公司（Cat：G7570）；總RNA提取試劑盒（Cat：ER101-01）、逆轉錄試劑盒（AH341-01）、實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)試劑盒（Cat：AQ131-01）和細胞凋亡試劑盒（Cat：FA101-01）購自北京全式金生物技術有限公司。

圖 1 VU0364439和VU0364770的分子結構Fig. 1 The molecular structures of VU0364439 and VU0364770

1.2 化學發光法測定細胞增殖活性

將乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和SK-BR-3鋪于96孔板中，每孔約1萬個細胞，在各孔中分別單獨加入不同濃度的VU0364439和VU0364770（4、20和100 μmol/L）及聯合加入VU0364439和VU0364770（4、20和100 μmol/ L），以相應濃度的DMSO溶液作為陰性對照組并準備無細胞培養基的對照孔，以獲得背景發光值。48 h后，每孔加入100 μL CellTiter-Glo?試劑，震蕩混勻2 min使得細胞裂解，室溫溫育10 min后，用分光光度計記錄熒光信號。

1.3 流式細胞術測定細胞凋亡

將乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和SK-BR-3鋪于6孔板中，每孔約40萬個細胞，在各孔中分別單獨加入不同濃度的VU0364439和VU0364770（4、20和100 μmol/L）及聯合加入VU0364439和VU0364770（4、20和100 μmol/ L），以相應濃度的DMSO溶液作為陰性對照組，48 h后，使用不含EDTA的胰酶消化收集細胞；用預冷的PBS洗滌細胞2次，500×g，4 ℃離心5 min，收集細胞；加入100 μL預冷的1×AnnexinⅤ結合緩沖液，重懸細胞；加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，輕輕混勻；室溫避光反應15 min；加入400 μL預冷的1×AnnexinⅤ 結合緩沖液，輕輕混勻，將樣品于冰上避光放置，1 h內用流式細胞儀檢測。

1.4 RTFQ-PCR檢測

1.4.1 RNA的提取

1.4.1.1 樣品處理

使用胰蛋白酶處理6孔板中培養的乳腺癌細胞（約4×105個），4 ℃ 12 000×g離心5 min；輕彈離心管底部，使細胞沉淀松散，加入相應體積的裂解液BB4（每1 mL BB4，加10 μL β-巰基乙醇，現用現配）。劇烈旋渦震蕩，直至細胞沉淀分散均勻；用RNase-Free的針管反復吹吸5～10次，使溶液均質化；室溫下12 000×g離心5 min，吸上清液于RNase-Free的離心管中。

1.4.1.2 RNA提取

向上清液中加入1倍體積70%乙醇，漩渦振蕩，分散沉淀；將得到的溶液和沉淀一起加入離心柱中，12 000×g離心30 s，棄掉流出液；向離心柱中加入500 μL CB4，室溫12 000×g離心30 s，棄掉流出液；加入500 μL WB4，室溫12 000×g離心30 s，棄掉流出液；室溫12 000×g離心2 min，徹底去除殘留的乙醇；將離心柱轉入一個新1.5 mL RNase-Free的離心管中，并向離心柱中央加50 μL RNase-Free Water，室溫靜置1 min；室溫12 000×g離心2 min，洗脫RNA；將RNA置于-80 ℃保存。

1.4.2 逆轉錄與RTFQ-PCR反應

逆轉錄反應體系：總RNA50 ng，5×SuperMix 4 μL，gDNA去除劑1 μL，加RNase-Free Water至20 μL。輕輕混勻體系，50 ℃溫育15 min，85 ℃加熱5 s失活逆轉錄酶及gDNA 去除劑。

RTFQ-PCR反應體系：cDNA模板 2 μL，正向引物0.2 μmol/L，反向引物0.2 μmol/L，2×RTFQ-PCR SuperMix 10 μL，加ddH2O至20 μL反應體系。

RTFQ-PCR反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40～45個循環，熔解曲線。GRM4上游引物為5’-TGAGGGTGCTGTCACGATCC-3’，GRM4下游引物為5’-ACGTGGCTGCCCTTCTTGAG-3’；β-actin上游引物為5’-ACAGAGCCTCGCC TTTGCCGAT-3’，β-actin下游引物為5’-CTTG CACATGCCGGAGCCGTT-3’。

2 結 果

2.1 GRM4正向別構調節劑抑制乳腺癌細胞增殖

在3種乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3中，VU0364439和VU0364770在濃度為100 μmol/L時，對3種乳腺癌細胞的增殖均有顯著的抑制作用，而濃度為4和20 μmol/L時抑制作用不明顯。VU0364439和VU0364770聯合使用時，也能夠抑制3種乳腺癌細胞的增殖，但抑制效果與單獨使用VU0364439和VU0364770基本一致（圖2）。

2.2 GRM4正向別構調節劑促進乳腺癌細胞凋亡

在MCF-7細胞中，DMSO處理組的平均細胞凋亡百分比（Q2+Q3）為16.36%，而加入VU0364439和VU0364770后，細胞凋亡百分比分別達到了32.47%和42.71%；與對照組相比，聯合使用VU0364439和VU0364770也顯著促進MCF-7細胞凋亡，但聯合使用與單獨使用相比差異無統計學意義（圖3）。

圖 2 化學發光法測定VU0364439和VU0364770的單獨使用和聯合使用對3種乳腺癌細胞增殖能力的影響Fig. 2 Chemiluminescence assay showed the eあect of VU0364439 and VU0364770, which were used alone or in combination on the proliferation of three breast cancer cells lines

圖 3 流式細胞術檢測單獨使用或聯合使用VU0364439和VU0364770對乳腺癌細胞系MCF-7凋亡的影響Fig. 3 Flow cytometry assay showed the eあect of VU0364439 and VU0364770, which were used alone or in combination on the apoptosis of breast cancer cell line MCF-7

2.3 GRM4正向別構調節劑促進GRM4基因的表達

RTFQ-PCR檢測GRM4在6種不同的乳腺癌細胞系及正常乳腺上皮細胞MCF-10A中的表達，如圖4A所示，GRM4在多數乳腺癌細胞及對照細胞中表達較低，而在MCF-7中表達水平最高。在MCF-7細胞中，單獨或聯合使用VU0364439和VU0364770均能促進GRM4的表達，而聯合使用VU0364439和VU0364770與單獨使用對GRM4基因表達的促進作用差異無統計學意義（圖4B）。

圖 4 VU0364439和VU0364770促進GRM4的表達Fig. 4 VU0364439 and VU0364770 promoted the expression of GRM4

3 討 論

GRM4是代謝型谷氨酸受體的一種亞型，是G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，GPCR）家族C組的成員。GRM4在腫瘤生物學中的研究報道較少，原因之一就是缺乏選擇性配體，特別是通過正位作用位點以外的區域起作用的別構調節劑［9］。本研究以體外培養的乳腺癌細胞系為研究對象，初步探討了VU0364439和VU0364770對乳腺癌細胞系增殖和凋亡的影響。研究發現，當兩種別構調節劑達到一定使用濃度時，均能夠抑制多種乳腺癌細胞的增殖，并且促進乳腺癌細胞凋亡；兩種別構調節劑聯合使用時，并沒有起到疊加效應。兩種別構調節劑均能夠促進GRM4基因的表達，但聯合使用與單獨使用相比差異無統計學意義。以上結果表明，GRM4可能是乳腺癌的抑癌基因。

別構調節劑是結合在別構酶的調節部位調節該酶催化活性的生物分子。別構調節劑可以是激活劑（正向），也可以是抑制劑（反向）。正向別構調節劑與GRM4的結合與調控作用機制極為復雜，可能涉及到蛋白構象的重組或相互作用蛋白及下游信號通路的改變，還可能通過正反饋通路促進GRM4基因的表達。事實上，一些正向別構調節劑已在腫瘤的治療中體現出了其潛在的臨床應用價值，如A型氨基丁酸受體GABAAR的正向別構調節劑3α-diol可以影響前列腺癌細胞的增殖［10］；MRS1477是TRPV1通道的正向別構調節劑，其與辣椒素的聯合使用能夠協同發揮抑制乳腺癌增殖的作用［11］。

GRM4作為抑癌基因的作用僅在神經管細胞瘤中有報道，而研究表明GRM家族的其他成員在多種腫瘤中發揮重要作用。GRM3主要表達于小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0的細胞凋亡中期，敲低GRM3能顯著抑制細胞凋亡［12］；GRM5與肝癌細胞的發生、發展關系密切，其抑制劑MPEP能夠促進肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞遷移［13］。GRM1是報道最多的GRM家族成員，其可作為乳腺癌抗血管生成治療方案的藥物作用靶點［14］，也是軟骨黏液樣纖維瘤中重要的致癌驅動基因［15］。由此可見，GRM家族的不同成員在各種惡性腫瘤中發揮不同作用。

綜上所述，本研究初步對GRM4的兩種正向別構調節劑對乳腺癌細胞增殖和凋亡的作用進行了探討，進一步配合一些常規化療藥物進行輔助治療驗證是我們下一步的研究目標，本研究為探索以GRM4為靶點的乳腺癌治療方案奠定了基礎。