痛瀉要方治療腸易激綜合征肝郁脾虛證VIP作用機制探討

陳富麗，竇志芳

（山西中醫藥大學，山西晉中030619）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一種以腹痛或腹部不適伴隨排便性狀或排便習慣反常為特征的一種功能性腸道疾病，其特點是整個腸道對刺激有異常的生理反應，但腸道壁無器質性病變。IBS是繼感冒之后的第二大常見病種，研究顯示，我國居民IBS發病率約為6.5%，多發于女性30～59歲年齡段［1］。IBS發病率高、病情纏綿，嚴重影響患者生活質量。

IBS發病機制十分復雜，目前尚未找到引起本病發生的真正原因，但研究顯示，本病與5-羥色胺（5-HT）、血管活性腸肽（VIP）、P物質、生長抑素（SS）等腦腸肽關系密切。前期研究發現，痛瀉要方通過疏肝、柔肝的作用，減少大鼠血清和結腸5-HT的含量，進而緩解IBS肝郁脾虛證大鼠的癥狀。本實驗在前期實驗基礎上，進一步研究痛瀉要方對IBS肝郁脾虛證大鼠血清和結腸中VIP含量的影響，分析痛瀉要方治療IBS肝郁脾虛證VIP作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠120只，SPF級，體質量（180±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK-（京）2012-0001。

1.1.2 試劑與儀器 大黃、番瀉葉顆粒劑（山西中醫學院附屬醫院提供）；痛瀉要方中藥顆粒劑（山西中醫學院附屬醫院）；匹維溴銨片（法國蘇威制藥廠）；VIP試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司）；4%多聚甲醛固定液（石家莊四藥有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司）；外科手術器械（上海浦倫醫療器械有限公司）；鼠斷頭器（安徽省淮北正華微生物儀器設備有限公司）；LT1002B電子天平（常熟市天量儀器有限責任公司）；HC-2062高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；KDC-1044低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Fm100型雪花制冰機（美國格蘭特化學公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SynergyTM H1全功能微孔板檢測儀（美國伯騰（BioTek）儀器有限公司）；IKA T25高性能數顯勻漿（分散）機（德國艾卡（IKA）公司）；EZQ-2旋渦振蕩器（江蘇省泰縣醫療器械公司）；LEICA RM2235石蠟切片機（德國Leica公司）；EG1150C石蠟包埋機（德國Leica公司）；EXCELSIOR ES脫水機（美國賽默飛世爾科技Thermo）；海信冷藏冷凍冰箱BCD-301WT/A（海信集團有限公司）；Transferpette-8移液器（德國Eppendorf）；肝素抗凝采血管等。

1.2 實驗方法

SPF級SD雄性大鼠120只，在晝夜光線、恒濕、恒溫的環境下自由進水進食飼養1 w，隨機分成6組：正常組、病理組、痛瀉要方低劑量組（低劑量組）、痛瀉要方中劑量組（中劑量組）、痛瀉要方高劑量組（高劑量組），西藥（匹維溴銨）組，每組20只。

除正常組外，余均用“束縛應激+番瀉葉灌胃法”造模，前肢束縛2 w，束縛應激+番瀉葉灌胃1 w。前肢束縛2 h/d，番瀉葉灌胃1次/d，造模結束。正常組和病理組均給予0.9%生理鹽水，按照10 mL/kg的劑量灌胃；低、中、高劑量組分別給予痛瀉要方藥液，按照 20、40、60 mg/kg的劑量灌胃；西藥組給予匹維溴銨，按照15 mg/kg的劑量灌胃。每天灌胃1次。連續10 d，實驗結束采集樣本檢測。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 血清VIP含量檢測 實驗結束第2天，一般狀態觀察結束，麻醉大鼠，腹主動脈取血，肝素抗凝試管中搖勻，4℃低溫高速離心15 min（3 000r/min），取上層血漿，于-26℃冰箱凍存，檢測前速融。使用大鼠VIP酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒檢測血清中VIP含量。

1.3.2 結腸黏膜VIP水平檢測 結腸黏膜VIP水平檢測［2］：采血結束，剖腹分離直腸段與結腸，截取結腸約6 cm，等分為3段，生理鹽水沖洗，分別置于4%多聚甲醛固定液中，24 h后放入自動脫水機中脫水，石蠟包埋，連續切片（5 μm），備用。

石蠟切片微波爐抗原修復的操作步驟：①石蠟切片常規脫蠟至水，蒸餾水沖洗3次；②用3%H2O2孵育8 min（根據實驗室溫度及其他條件決定），阻斷內源性過氧化酶，用蒸餾水洗3次，5min/次；③PBS沖洗 3次，5 min/次；④將切片置入裝有0.01M枸櫞酸鹽緩沖液pH（6.0±0.1）的容器內，放入微波爐抗原修復10 min；⑤取出，在常溫下自然冷卻，用PBS洗3次，5 min/次。

免疫組化染色步驟：①滴入適當的1∶100稀釋兔抗鼠VIP或NGF多克隆抗體，陰性對照用PBS代替一抗，4℃過夜；②用PBS沖洗3次，3 min/次；③滴加二抗工作液，在37℃孵育20 min；④用PBS沖洗3次，3 min/次；⑤DAB室溫顯色，光鏡下控制反應時間；⑥自來水沖洗；⑦蘇木素復染；⑧梯度酒精脫水，二甲苯透明中性樹膠封片。每張完成染色的切片在OlympsDP70光學顯微鏡高倍鏡400倍下觀察。

1.4 統計學方法

實驗結果分析、統計圖表繪制均采用Graphpad prism 5，統計結果以均數±標準差（±s）表示。

2 結果

2.1 血清VIP含量檢測結果

與病理組比較，治療各組均明顯下降，與正常組比較，中藥各組均較為接近正常組，特別是中藥高劑量組更為接近，西藥組偏高。結果見表1。

圖1 VIP陽性細胞

表1 各組大鼠血清中VIP及D-木糖含量檢測結果

2.2 結腸黏膜VIP水平檢測結果

與病理組比較，治療各組均明顯下降，與正常組比較，痛瀉要方各組均較為接近正常組，西藥組偏高。

每張切片在高倍鏡下隨機選取3個視野并拍照，圖像選用Image-Pro Plus5.1專業圖像分析系統處理，光鏡下，VIP陽性細胞結果見圖1。

測量每個視野中免疫組化染色陽性的細胞面積（Area），計算3張圖片的Area的平均值作為此標本的代表值。各組Area值與正常組比較，結果見圖2。

3 討論

圖2 各組大鼠結腸VIP免疫組化染色陽性細胞面積（Area）檢測結果

3.1 VIP是IBS等胃腸疾病研究的重要指標之一

VIP又名舒血管腸肽，是腸神經系統最具代表性、研究最為深入的神經肽［3］，是一種重要的肽類神經遞質。VIP廣泛分布在消化、免疫、循環、生殖系統及中樞與外周神經系統中。VIP具有雙重作用，既是胃腸道激素，又是神經肽，因此被認為是腦腸肽的一種。VIP功能多樣，在臨床上與多種疾病相關，特別是與胃腸道疾病的關系密切，被認為是胃腸道疾病研究的重要指標之一。

VIP主要是由中樞神經和外周神經系統所產生，副交感神經節后纖維所釋放，與乙酰膽堿共存［4］。胃腸黏膜散在的內分泌細胞和神經中也有VIP的合成與釋放，此外，在機體內絕大多數淋巴器官中也發現有分泌VIP的神經纖維［5］。部分免疫細胞也在少量產生VIP，如嗜酸粒細胞、肥大細胞等。另外，某些個腫瘤細胞，如胃癌細胞、結腸癌細胞等也分泌 VIP［6］。

VIP具有舒張血管、激素分泌、平滑肌舒張、抗炎和免疫調節等多種生理功能［7］。在消化系統中，VIP生理功能主要體現在：①促進小腸水和電解質的分泌，調節胰腺外分泌；②松弛胃腸道平滑肌和括約肌，松弛膽囊等；③抑制胃酸的分泌；④釋放肝糖原；⑤舒張血管，增大血流量，加大收縮力；⑥促進胰島素與胰高血糖素的分泌［7-9］。

VIP功能多樣，在臨床上與多種疾病相關，特別是與胃腸道疾病的關系密切，被認為是胃腸道疾病研究的重要指標之一。

3.2 VIP對IBS的作用

VIP對IBS的作用主要體現在兩方面，一是促進胃腸激素和小腸水、電解質的分泌。二是對胃腸道平滑肌有舒張作用，從而抑制腸道動力。

IBS是一種常見的以腸功能紊亂為主的功能性疾病，對其病因和發病機制目前認為，內臟敏感性增強是IBS基本的病理生理改變，其內臟高敏感的發生機制較為復雜，涉及胃腸道局部及腦等多個層面。如起源于腸壁感知的異常、內臟感覺中樞傳導通路的異常等。在結腸部位VIP的含量最高，主要分布在腸壁內神經叢和平滑肌層，其絕大多數以神經遞質的方式發揮局部調節的作用。作為傳入神經，VIP既對腸道平滑肌具有明顯的舒張作用，又是一種參與神經元分泌調節的興奮性遞質，具有促進腸道水與電解質分泌的功能。IBS患者結腸黏膜VIP含量顯著高于正常，且與其腹痛、腹瀉、便秘等癥狀的發生有關［10］。然而小腸VIP的含量如何來影響腸道傳輸功能尚有待進一步研究。有研究者用RIA檢測發現，IBS腹瀉型患者血中VIP含量較正常人空腹時顯著上升，升高的VIP一方面刺激胃黏膜分泌細胞增加水和電解質的分泌進而導致腹瀉；另一方面VIP對胃腸道的抑制作用，使腸道動力不足而導致收縮不良，出現腹瀉與便秘交替出現。便秘型IBS患者結腸黏膜 VIP含量升高抑制腸動力使腸道的蠕動減弱，進而導致便秘。所以血漿VIP水平升高可作為診斷IBS的一個重要的證據。

綜上所述，VIP在胃腸道及中樞神經系統中含量最多，其在腸道中不僅起著調節胃腸激素的作用，更為重要的是以神經遞質的形式發揮著作用。胃腸道全層均分布有VIP，目前普遍認為其對胃腸道平滑肌具有舒張作用［11］，從而對胃腸運動起抑制作用，又有促進腸道水分和電解質分泌。有文獻報道腹瀉型IBS患者血漿的VIP含量顯著高于正常組（P<0.05）［12］；李合國等［13］也有報道脾虛腹瀉型IBS模型大鼠的血漿VIP水平顯著升高，有實驗研究提出，腹瀉型IBS大鼠結腸的VIP表達上調，可能與其刺激胃腸黏膜分泌細胞增加水、電解質的黏膜分泌、腸液增多有關［14］。但是也有研究顯示IBS大鼠結腸VIP表達具有下降趨勢［15］，IBS這些研究均有力地證明VIP與IBS關系密切，但是目前尚無統一結論，所以從大鼠發病到治療過程中，通過觀察分析其血清及腸黏膜VIP含量的變化可以探討痛瀉要方治療IBS的內在作用機制。

大量研究表明，5-HT是IBS的發病機制的關鍵因子，5-HT能影響胃腸動力、分泌、內臟感知及精神心理。前期研究發現，病理組大鼠血清和腸黏膜5-HT水平相比正常組很高，治療后各組均有降低，但是痛瀉要方高劑量組接近正常水平。本實驗結果病理組大鼠血清和結腸VIP含量較正常組明顯升高（P<0.01），而通過低、中、高劑量的痛瀉要方和匹維溴銨治療之后，VIP含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），且高劑量組的VIP含量與正常組最為相近，這與5-HT的變化趨勢極為相似。

IBS是一種以腹痛、腹瀉、便秘或便秘與腹瀉交替出現為主癥，同時伴有精神情志方面的一組典型胃腸功能性疾病，大量研究表明，5-HT不僅影響胃腸動力、分泌、內臟感知還有影響精神心理的作用。而目前認為VIP對IBS的作用主要體現在兩方面，一是促進胃腸激素和小腸水、電解質的分泌；二是對胃腸道平滑肌有舒張作用，從而抑制腸道動力。

綜上所述，從本實驗結果來看就IBS肝郁脾虛證而言，VIP含量的增高，應該是胃腸道動力增強以后所產生的一種負反饋機制而造成的，而它本身促進胃腸激素和小腸水電解質的分泌功能僅僅是一個附帶作用，換言之，就是VIP的升高是來抑制由于5-HT的升高導致的腸動力及分泌功能過強這一病理現象的，所以VIP可以作為診斷本病和評價療效的一個客觀指標。