不同強度電針風池、曲池穴對原發性高血壓大鼠NF-κB P65蛋白及其基因表達的影響

丁 麗

（安徽中醫藥大學第二附屬醫院心內科，安徽合肥230061）

原發性高血壓病主要表現為體循環動脈壓升高的臨床綜合癥，促使并加重心腦腎疾病的進程，給人類健康帶來極大危害［1］。中醫無論是單純針灸還是針藥結合等方式治療該病療效確切，具有簡便廉的特點，同時又可避免藥物的不良反應。風池穴歸屬于足少陽膽經，足少陽膽經與陽維脈會于風池，又稱“諸陽之會”。足厥陰肝經上行頭部，肝具有升發作用，過則病生，如頭暈頭昏等癥發作；肝氣暢達，則腦目清爽。肝氣舒暢則利于脾臟健運，痰濕難生，百病自去。曲池穴歸屬于手陽明大腸經，為該經之合穴，“合主逆氣而泄”，調攝陽明氣血平和。本實驗通過觀察電針對大鼠血管內皮細胞組織相關因子及NF-κB P65蛋白表達的影響，進一步揭示電針“風池”“曲池”穴對原發性高血壓NF-κB P65蛋白表達的影響，闡明其對高血壓的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

80只原發性高血壓大鼠（Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co.Ltd.機構編號：SCXK（京）2012-0001），Wistar-Kyoto大鼠16只，體重（200±50）g，12 w 齡，雌雄各半。

1.2 儀器與試劑

酶標儀（雷杜，型號RT-6000）；電熱恒溫箱（上海三發，型號DNP-9052BS-Ⅲ）；移液器（eppendorf，型號 0.5-10 uL）；離心機（安徽嘉文，型號JW3021HR）；大鼠脂聯素（上海源葉生物技術有限公司，型號CK-E30554R&E20170801A）；大鼠非對稱二甲基精氨酸（上海源葉生物技術有限公司，型號 CK-E92975R&E20170801A）；KWD-808脈沖電針儀（英迪電子醫療器械，Ⅰ型）等。

1.3 分組與給藥

將80只SHR大鼠隨機分為模型組、西藥組、低強度電針組（低針組，刺激電流1 mA，頻率為2 Hz）、中強度電針組（中針組，刺激電流3 mA，頻率為2 Hz）、高強度電針組（高針組，刺激電流5 mA，頻率為2 Hz）5組，每組16只，正常組WKY16只。

正常組及模型組每天灌服2 mL/次生理鹽水；低針組：刺激電流1mA，頻率為2 Hz；中針組：刺激電流3 mA，頻率為2 Hz；高針組：刺激電流5 mA，頻率為2 Hz。西藥組：濃度為0.18 mg/mL的貝那普利混懸液每天0.9 mg/kg灌胃1次。

大鼠均飼養在擁有空氣自動清化器的飼養室內，溫度適宜。先標準飼料適應性喂養1 w，實驗期間繼續予標準大鼠飼料喂養，自行滾珠式飲水器。

1.4 標本采集及指標檢測

1.4.1 APN、ADMA測定 分別于實驗前于大鼠眼眶后采集血液，實驗結束時腹主動脈采血，放EP管中貯存于-20℃冰箱保存待測。ELISA法檢測血清APN、ADMA水平。

1.4.2 NF-κB P65mRNA的檢測 取研究組織100mg左右，破碎，將TRIzol 1 mL加入每孔中，低溫放置5 min。移裂解液至EP管，取0.2 mL氯仿，充分搖晃15 s，3 min常溫下。12 000 rpm 4℃離心15 min，取上清加到另一EP管中，異丙醇0.5 mL，混勻10 min。4℃12 000 rpm離心10 min，棄上清。加入1 mL 75%乙醇（DEPC水配制），4℃12 000 rpm離心5 min，棄上清，室溫放置30 min干燥RNA沉淀。加入 20～50 μL DEPC 水，55℃促溶 10 min，-80℃保存備用。在0.2 mL EP管中，加入總RNA（質量為1 μg）、10 μM Oligo（dT）1 μL、DEPC 水補足至 12 μL，輕輕混勻、點動離心。PCR儀上65℃加熱5 min，立即冰浴3 min。在上述EP管中加入5×Reaction Buffer 4.0 μL、10 mM dNTP Mix 2 μL、RibolockTM Rnase inhibitor 1 μL、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase 1 μL。42℃ 60 min，70℃ 5 min。取出上述反應液，即為cDNA，-80℃保存備用。

1.4.3 NF-κB P65蛋白的檢測 取組織樣品100 mg左右，加RIPA液1 mL細胞裂解。12 000 rpm離心10 min。取含總蛋白組織上清液。在收集的蛋白樣品中按照1∶4加入5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。蛋白全變性加熱10 min沸水。冷卻樣品5～20 μL直加入SDS-PAGE膠孔內。濃縮膠30 min，電壓80 V；分離膠1 h，電壓120 V。將PVDF膜沉入轉膜液5 min。除氣泡，轉膜裝置對齊每步。接通電源，300 mA恒流轉膜90 min。完成后，把PVDF膜放到預先Western液中5 min，洗掉轉膜液。5%脫脂奶粉放入Western封閉液，勻而慢搖床，密封2 h。一抗稀釋液（抗體NF-κb P65為鼠抗1∶300稀釋；分離膠10%），4℃慢搖孵化一晚。放入PBST；1∶10 000二抗稀釋辣根過氧化物酶標注二抗。孵化2 h常溫。均10 min洗1次，總共3次。行蛋白檢測。

1.5 統計學方法

SPSS 19.0軟件統計學處理。實驗數據結果以均數±標準差（±s）表示，多組間比較進行方差齊性檢驗，采用單因素方差分析（兩兩比較采用S-K檢驗，方差不齊者采用Dunnett檢驗），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清APN含量

模型組大鼠血清APN含量明顯低于正常組（P＜0.01）；治療后各治療組較模型組APN均有增高趨勢（P＜0.01），其中高針組效果顯著優于西藥組（P＜0.05）。結果見表 1。

表1 各組大鼠治療前后APN含量 （±s）

表1 各組大鼠治療前后APN含量 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與本組治療前比較，2）P＜0.01；與西藥組比較，3）P＜0.05

組別 n 實驗前 實驗后正常組 16 0.48±0.041） 0.48±0.031）模型組 13 0.24±0.02 0.20±0.02西藥組 13 0.25±0.04 0.35±0.031）2）低針組 12 0.24±0.03 0.36±0.021）2）中針組 12 0.24±0.04 0.39±0.031）2）高針組 13 0.25±0.05 0.46±0.071）2）3）

2.2 各組大鼠血清ADMA含量

模型組大鼠ADMA較正常組高（P＜0.01）；實驗后各治療組較模型組ADMA均明顯下降（P＜0.01），且高針組效果顯著優于西藥組（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠治療前后ADMA含量 （±s）

表2 各組大鼠治療前后ADMA含量 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與西藥組比較，2）P＜0.01；與本組治療前比較，3）P＜0.01

組別 n 實驗前 實驗后正常組 16 0.25±0.011） 0.34±0.041）模型組 13 0.40±0.05 0.52±0.10西藥組 13 0.49±0.12 0.36±0.051）3）低針組 12 0.50±0.17 0.38±0.401）3）中針組 12 0.41±0.02 0.36±0.001）3）高針組 13 0.38±0.08 0.22±0.091）2）3）

2.3 NF-κB P65基因及蛋白表達水平

模型組SHR大鼠血管內皮細胞NF-κB P65基因及蛋白相對表達量明顯高于正常組（P＜0.01）；各治療組大鼠血管內皮細胞NF-κB P65基因及蛋白相對表達量均低于模型組（P＜0.01），且低針組效果優于西藥組（P＜0.05），高針組、中針組優于低針組（P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠NF-κB P65基因及蛋白相對表達量 （±s）

表3 各組大鼠NF-κB P65基因及蛋白相對表達量 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.01；與西藥組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01；與低針組比較，4）P＜0.01

組別 n NF-κB P65mRNA NF-κB P65正常組 16 0.21±0.031） 0.10±0.021）模型組 13 1.01±0.07 0.74±0.01西藥組 13 0.84±0.121） 0.60±0.011）低針組 12 0.65±0.061）2） 0.46±0.051）2）中針組 12 0.53±0.171）3）4） 0.29±0.021）3）4）高針組 13 0.51±0.071）3）4） 0.28 ±0.041）3）4）

3 討論

原發性高血壓屬中醫學“眩暈”范疇。中醫學認為本病主要病位在肝、腎，陰陽失調為病之本，風、火、痰、瘀為病之標，兼有虛實夾雜。

圖1

圖2 NF-κB P65擴增曲線

圖3 NF-κB P65溶解曲線

針刺治療原發性高血壓病歷史悠久，現代文獻研究表明，針刺治療高血壓病在降壓療效方面與西藥相當［2］。韓路璐等［3］研究表明，曲池穴使用頻次是15.1%，風池穴是12.8%，依次位居第二和第三。張立婧等［4］研究發現排在前三位降壓主穴依次是太沖、風池、曲池。陳邦國等［5］研究針刺曲池等穴通過拮抗血漿ET升壓反應達到降壓目的。范然等［6］認為針刺曲池等穴可以修復和改善不良血管內皮結構與功能，延緩或逆轉原發性高血壓靶器官的損傷及動脈硬化進展。王艷富等［7］電針曲池穴治療后發現，血漿神經肽濃度較治療前明顯下降，進而降低血壓，控制高血壓的發生。王偉等［8］針刺風池、曲池聯合天麻鉤藤飲治療原發性高血壓病，效果顯著。陳琴等［9］研究證實曲池、風池穴對高血壓降壓有療效。陳寧勇等［10］針刺風池、曲池等穴治療高血壓療效明顯。

目前非對稱性二甲基精氨酸、脂聯素與高血壓病的相關性越來越被重視。Vallance最早發現血漿ADMA含量增高與心血管事件相關。已證實ADMA不僅是一個高血壓病獨立危險因子，而且影響到內皮功能不全程度。ADMA可能是致高血壓病多種危險因素之一，其對內皮功能、血壓和心臟功能具有意義［11］。

Gardiner S M等［12］研究表明ADMA可引起升壓反應，呈劑量依賴性使動脈、下肢血管收縮等導致平均血壓升高。既往研究給予高血壓患者高鹽飲食會使血漿ADMA升高，血壓進一步增高［13］。龔菲［14］發現血漿ADMA含量與高血壓分級正相關，與收縮壓獨立相關。王建榮等［15］發現高血壓組、急性冠脈綜合征組血漿ADMA含量均高于對照組，以ACS組含量最高，差異明顯，NOS、NO水平與ADMA負相關，說明ADMA影響血管內皮功能，可指導臨床診療。通過實驗發現，不同強度電針風池及曲池穴可以使血清ADMA含量下調，進而改善血壓，降低血管內皮的損傷。

研究發現APN在血管內皮功能、抗炎、抗動脈硬化方面具有重要作用。血漿中的APN含量下降，是心血管病風險增高的信號［16］。Wang L 等［17］對800例前瞻性研究中得出脂聯素含量和高血壓病風險呈負相關。Brambilla P 等［18］研究發現，血漿中APN含量降低會加重血管內皮細胞功能損傷。不僅是天然屏障，還促使生成、激活和釋放一些血管活性物質，APN通過AMPK信號轉導途徑增強內皮型一氧化氮合酶磷化，提高兩者協同效應，發揮活力。APN還可以提高eNOS mRNA的穩定性，延長其半衰期。故APN可能參與高血壓進程［19］。趙普香［20］研究發現貝那普利能夠使APN濃度上調，并有效控制血壓。通過實驗發現，不同強度電針風池及曲池穴可以使血清APN含量上調，改善血壓及血管內皮細胞功能。

核因子-κB通過抑制蛋白即與NF-кB進行解離使得NF-кB向細胞核轉移，通過參與機體細胞核的轉錄過程，影響各細胞因子的生成和表達。陳大帥等［21］臨床試驗結果指出，原發性高血壓患者較健康人群NF-кBP65陽性細胞率增高。劉巖［22］研究發現醛固酮上調MCP-1炎癥因子表達，少不了NF-кB 作用。CaPno M 等［23］在原發性高血壓小鼠實驗中使用腺病毒轉染抑制蛋白突變體進行實驗，通過抑制NF-кB的活化，從而降低血壓。Sanz-Rosa D［24］發現醛固酮一方面通過增加水鈉潴留使血壓增高，同時血管炎癥反應也參與其中，似乎是由NF-кB活性增強增加血管細胞因子表達所致。通過實驗發現，不同強度電針風池及曲池穴可能通過使NF-кBP65蛋白表達量下調，達到降低血壓的作用。

本實驗證實不同強度電針風池及曲池穴可能通過下調NF-кBP65蛋白表達量，進而下調血清ADMA含量及上調血清APN含量，達到修復血管內皮細胞功能，降低血壓的目的。