稻秸酶解和沼氣發酵臭氧氨水聯合預處理技術研究

王殿龍 艾 平 張衍林

(1.淮陰工學院生命科學與食品工程學院， 淮安 223003； 2.江蘇省生物質轉化與過程集成重點實驗室， 淮安 223003；3.華中農業大學工學院， 武漢 430070)

0 引言

近年來由于能源問題和全球變暖問題，可再生能源受到了廣泛關注[1]。利用木質纖維素原料水解糖化產乙醇和沼氣發酵是非常重要的生物質轉化技術[2-3]。我國秸稈類生物質資源豐富[4]，價格低廉，其成分主要為32%～47%的纖維素、19%～27%的半纖維素和5%～24%的木質素[5]。纖維素主要分布在結晶區，而半纖維素主要在非結晶區[6]。研究表明纖維素的結晶結構限制了木質纖維素的利用，使生物煉制過程中纖維轉化率和能源產量降低[7]。因此，多采用預處理技術破壞細胞壁的化學結構，提高木質纖維素糖化和發酵產沼氣的效率[8]。

臭氧預處理一直被認為具有較好的木質素去除能力，而且纖維素和半纖維素的損失較少。也有研究發現臭氧通過選擇性地與碳碳雙鍵反應、斷裂糖苷鍵，使木質素分解[9]，而且臭氧對木質素的氧化作用使得木質素結構濃縮。WU等[10]也發現臭氧預處理可有效去除木質素，而且臭氧用量越高，脫木質素效果越好，還原糖產量越多。

另外，由于氨水可有效地脫除木質素，因此眾多學者廣泛地研究了氨水浸泡預處理[11]。研究表明氨水預處理可去除稻秸中60%的木質素，達到70%的酶解消化能力[12]。對于氨水預處理，學者提出纖維擴張理論，即氨分子的逐漸滲透使得生物質纖維結構膨脹，增加生物質表面積[13]；另外，氨可以選擇性地與木質素的各個鍵反應，尤其是C—O—C鍵、酯鍵和醚鍵，選擇性地移除生物質中的木質素。更重要的是，氨水處理成本低，氨易回收。LI等[14]通過浸泡氨水預處理有效提高了葡萄糖和乙醇產率；也有研究發現氨水預處理的脫木質素能力與沼氣產量呈正相關[15-16]。

基于此，本文提出采用臭氧氨水聯合預處理稻秸，采用臭氧處理破壞木質素的化學結構，降低對纖維素和半纖維素的影響；然后采用浸泡氨水處理，通過氨水與木質素中的酯鍵和醚鍵反應，進一步溶解木質素，使得纖維膨脹，增加與厭氧菌或者纖維素酶的接觸面積，提高轉化效率。通過控制臭氧用量和氨水浸泡時間，考察臭氧氨水聯合預處理對酶解單糖質量濃度、還原糖質量濃度和木質纖維素組分的變化規律，同時也研究臭氧氨水聯合預處理對稻秸厭氧發酵產甲烷效果的影響，分析沼氣產率、稻秸木質纖維素組分和結晶度變化，揭示臭氧氨水聯合預處理稻秸的纖維降解機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

稻秸取自華中農業大學水稻田，自然風干后粉碎備用；接種污泥取自華中農業大學正常運行的以豬糞為發酵原料的戶用沼氣池，具體實驗原料參數如表1所示。

表1實驗原料的特性

Tab.1 Characteristics of experimental materials%

1.2 實驗方法

1.2.1稻秸臭氧氨水聯合預處理酶解實驗

臭氧氨水聯合預處理實驗中，首先將稻秸和去離子水混合使其含水率為40%，取16.67 g濕秸稈(含10 g干物質)放入不銹鋼反應器進行臭氧預處理，XKH-YA10G型臭氧發生器的臭氧產生質量濃度為16.67 mg/L，流速控制在10 L/min，臭氧預處理時間為0、15、30、45、60、75 min，則臭氧用量分別為0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 g/g(以秸稈質量計)，臭氧預處理完成后，將秸稈置于45℃干燥箱；然后，取臭氧預處理后的稻稈7.5 g，加入100 mL質量分數為26%～28%的氨水，固體質量分數為7%，密封瓶口后置于50℃水浴鍋中浸泡0、2、4、6、8、10 h，預處理完成后，固體樣品經通風櫥下洗滌、干燥后進行組分測定和酶解實驗。聯合預處理過程中，當研究臭氧用量影響時，氨水浸泡時間設定為4 h；當研究氨水浸泡時間影響時，臭氧用量采用0.75 g/g。

在酶解過程中，取3 g臭氧氨水聯合預處理后的稻秸，加入乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(0.05 mol/L，pH值4.8)60 mL。纖維素復合酶(β-葡聚糖酶活力大于等于6×104U，纖維素酶活力大于等于600 U，木聚糖酶活力大于等于1×105U)來自寧夏和氏壁生物技術有限公司，在150 r/min和50℃下酶解60 h，每隔12 h取液樣分析單糖和還原糖質量濃度。

1.2.2稻秸臭氧氨水聯合預處理批式產甲烷實驗

為了研究臭氧氨水聯合預處理對稻秸沼氣發酵潛力的影響，取20 g稻秸進行臭氧氨水聯合預處理：研究臭氧用量(0、0.5、1.0、1.5 g/g)影響時，氨水浸泡時間設定為6 h；研究氨水浸泡時間(0、3、6、9 h)影響時，臭氧用量設定為1.0 g/g。沼氣發酵采用500 mL發酵瓶，取15 g臭氧氨水聯合預處理后的稻秸，加入75 g新鮮接種污泥和230 mL蒸餾水使得總固體質量分數為7%，啟動期為避免酸化，加入1.5 g NaHCO3提供緩沖，將裝好的發酵罐置于恒溫水浴鍋中發酵，發酵溫度37℃。實驗過程中每隔24 h采用排水法測量日沼氣產量，用1 mL注射器收集沼氣。

1.3 檢測方法

總固體質量分數采用105℃干燥24 h，揮發性固體質量分數采用550℃灰化4 h，差重法測定；木質纖維素成分采用ANKOM A2000i型全自動纖維分析儀，根據范式洗滌法測定；單糖質量濃度采用安捷倫1220型液相色譜儀測定，Zorbax型碳水化合物分析柱，示差折光檢測器，柱溫和檢測器溫度為35℃，流動相為75%乙腈，流速為0.8 mL/min；沼氣氣體成分采用GC9790II 型氣相色譜儀測量，檢測器為TCD(熱導檢測器)，分析柱為5A分子篩不銹鋼填充柱和Hayesep Q型填充柱，柱箱溫度50℃，進樣口溫度為100℃，檢測器溫度為55℃，載氣為氬氣。

2 結果與討論

2.1 臭氧氨水聯合預處理對稻秸酶解效果的影響

2.1.1失重率

臭氧用量和氨水浸泡時間對稻秸預處理失重率的影響如圖1所示。隨著臭氧用量的增加，失重率整體變化較小，變化范圍在29.20%～32.67%之間，略低于采用稀堿預處理得到的失重率(25%～50%)[17]和微波聯合稀堿預處理得到的失重率(41.5%～44.6%)[18]。當氨水浸泡時間由2 h增加到10 h，稻秸失重率也從26.40%升高到40.27%。氨水浸泡10 h的失重率為最高，有利于提高酶解還原糖濃度。但由于失重率過高會導致纖維素損失較高，使得酶解過程中葡萄糖得率或厭氧發酵過程中產氣率較低。因此，對于臭氧氨水聯合預處理，采用臭氧用量0.75～1.00 g/g和氨水浸泡6 h為宜。

圖1 臭氧氨水聯合預處理對失重率的影響Fig.1 Effect of combined ozone and soaking aqueous ammonia pretreatment on weight loss rate

2.1.2稻秸酶解糖化效率

通過分析不同條件下預處理稻秸酶解60 h后葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和還原糖質量濃度，探索臭氧和氨水聯合預處理過程中臭氧用量和氨水浸泡時間對稻秸酶解糖化效率的影響。臭氧用量(0～1.25 g/g)對單糖和還原糖質量濃度的影響如圖2所示，可以看出，隨著臭氧用量的升高，葡萄糖質量濃度先增加后降低，在0.75 g/g臭氧用量時葡萄糖質量濃度最高，為36.92 g/L (60 h)；對于半纖維素的水解，臭氧用量越低，木糖質量濃度越低，而阿拉伯糖質量濃度越高，這表明當臭氧用量高于0.5 g/g時有利于半纖維素的水解，減少木糖進一步分解產生抑制物[19]。從酶解60 h后的還原糖質量濃度來看，0.75 g/g的臭氧用量獲得了最高還原糖質量濃度，為65.71 g/L，比最低的還原糖質量濃度(49.09 g/L)高了33.86%，因此，0.75 g/g的臭氧用量為最佳。

與臭氧用量相比，氨水浸泡時間對單糖和還原糖質量濃度影響較大。氨水預處理0 h的葡萄糖質量濃度明顯低于其他實驗組(圖3，如氨水預處理2 h的葡萄糖質量濃度比未處理組高了50.02%。隨著氨水浸泡時間從4 h增加到10 h，葡萄糖質量濃度無明顯變化。而且木糖質量濃度與氨水浸泡時間也無明顯正相關的趨勢(圖3b)。葡萄糖和木糖質量濃度的變化表明氨水預處理對纖維素的解聚作用高于降解半纖維素的作用[20]。所有處理組的阿拉伯糖質量濃度均低于1.3 g/L，而且阿拉伯糖質量濃度與氨水浸泡時間呈正相關趨勢(圖3c)，氨水浸泡10 h的阿拉伯糖質量濃度明顯高于其他組。氨水浸泡2 h和4 h的還原糖質量濃度分別為48.23 g/L和54.89 g/L，與未處理組(30.15 g/L)相比提高了59.97%、82.06%(圖3d)，在酸解60 h時，氨水浸泡6 h的還原糖質量濃度為60.51 g/L，而氨水浸泡6 h和8 h的還原糖質量濃度相差不大。氨水預處理10 h的還原糖質量濃度為最高，這是由于氨水預處理時間越長，木質素降解率越高，從而導致預處理后稻秸中纖維素含量越高，且稻秸的比表面積越大。綜上，臭氧氨水聯合預處理可有效提高稻秸的酶解糖化效率，適宜的臭氧氨水聯合處理條件為0.75 g/g臭氧用量和6 h氨水浸泡時間。

圖2 臭氧用量對酶解過程中單糖和還原糖質量濃度的影響Fig.2 Effect of ozone dosage on mono-sugars and reducing sugars concentrations during enzymatic hydrolysis process

圖3 氨水浸泡時間對酶解過程中單糖和還原糖質量濃度的影響Fig.3 Effect of soaking aqueous ammonia time on mono-sugars and reducing sugars concentrations during enzymatic hydrolysis process

2.1.3預處理和酶解過程中木質纖維素組分變化

與原始稻秸相比，預處理和酶解后的木質纖維素組分變化如圖4所示。臭氧用量的增加有利于半纖維素和木質素的去除，半纖維素質量分數由37.89%降低至31.94%～32.99%，而且隨臭氧用量增加，半纖維素含量無明顯變化，這與失重率和單糖還原糖質量濃度結果相似。也有研究表明臭氧用量超過最優值時不能提高預處理作用[21]。隨著臭氧用量的增加，預處理后的纖維素含量也逐漸升高，質量分數為58.39%～63.21%，在酶解過程中降低至54.18%～58.56%，這表明酶解過程中纖維素降解率高于預處理過程中纖維素降解率，減少了預處理過程對纖維素的損失。不同臭氧用量預處理后木質素含量沒有明顯的變化，預處理前木質素質量分數為3.36%，0～1.25 g/g的臭氧預處理后木質素質量分數為2.99%～4.89%。盡管臭氧預處理對木質素去除較為有效，但預處理稻秸中的木質素仍較高。然而在酶解過程中，木質素含量繼續升高，質量分數為8.67%～11.58%，這是因為纖維素復合酶僅對纖維素和半纖維素具有降解作用，使得木質素含量相對升高。

隨著氨水浸泡時間的增加，纖維素含量逐漸增加，而半纖維素含量逐漸降低。原始稻秸中纖維素質量分數為53.28%，氨水浸泡2～10 h后纖維素含量分別為58.01%、60.27%、61.64%、61.96%和63.54%。纖維素含量的增加是由預處理過程中纖維素的降解率比半纖維素和木質素低導致的。盡管纖維素在預處理過程中明顯增加，但是酶解后的纖維素質量分數仍較高，這是因為纖維素復合酶能夠有效地水解稻秸中的纖維素和半纖維素，從而導致纖維素和半纖維素含量同時降低，進而酶解殘渣中纖維素含量并未降低，這一點從單糖和還原糖質量濃度上可以相互印證。氨水具有較強的脫木質素作用[22]，而對半纖維素的降解作用較小，但臭氧氨水聯合預處理也可促進半纖維素的水解。氨水浸泡2～10 h，半纖維素質量分數由41.13%降低至30.34%～33.84%，木質素含量也明顯降低，這與LI等[14]的研究結果相似。由于酶解和厭氧發酵對木質纖維素降解效果不同，因此進一步考察臭氧用量和氨水浸泡時間對稻秸厭氧發酵產氣和纖維降解的影響。

圖4 預處理和酶解后木質纖維素組分的變化Fig.4 Changes of lignocellulose components after pretreatment and enzymatic hydrolysis

2.2 臭氧氨水聯合預處理對稻秸沼氣發酵效果的影響

2.2.1預處理后木質纖維素組分

為了研究臭氧氨水聯合預處理對稻秸降解及沼氣產率增加的機理，表2給出了預處理過程中木質纖維素組分的變化。在臭氧預處理過程中，纖維素含量降低，而且臭氧用量越高，纖維素含量越低；半纖維素含量也隨著臭氧用量的增加而減少。對于木質素而言，盡管預處理后稻秸中木質素的質量分數相對增加，但臭氧可選擇性地與碳碳雙鍵反應，從而破壞和降解木質素。木質素的溶解主要發生在氨水預處理階段，KIM等[23]采用15%的氨水處理玉米芯，在氨處理12 h時木質素去除率達62%。氨水浸泡時間越長，半纖維素和木質素損失越高，預處理秸稈中的纖維素含量越高，這對于后期甲烷轉化或乙醇轉化是有利的。氨水浸泡0～9 h，纖維素質量分數從36.22%增加到52.13%；半纖維素質量分數從23.92%降低至17.54%。與對照組相比，木質素含量明顯升高，但從氨水浸泡3～9 h來看，木質素質量分數由8.16%逐漸降低至4.43%，可以體現出木質素的降解過程。

2.2.2沼氣產量

從日產氣量(圖5)可以看出，前期酸化產揮發酸過程產氣量相似，第6天后沼氣產量迅速升高，而且預處理后的稻秸日產氣量明顯高于無處理組；其中臭氧用量為1.0 g/g實驗組，日產氣量的高峰期

表2 臭氧氨水聯合預處理稻秸的木質纖維素組分變化Tab.2 Changes of lignocelluloses components of rice straw pretreated by ozone and ammonia

延后，累積沼氣產量與1.5 g/g臭氧用量實驗組相近，分別為4 570 mL和4 605 mL，分別高于0.5 g/g實驗組(4 245 mL)7.66%和8.48%。因此，綜合臭氧成本和沼氣產量考慮，1.0 g/g的臭氧用量在產氣性能上具有一定優勢，累積沼氣產量達4 570 mL，相比未處理組(3 305 mL)提高了38.28%。

圖5 不同臭氧用量和氨水浸泡時間條件下的沼氣產量Fig.5 Biogas production at different ozone dosages and soaking aqueous ammonia times

不同氨水浸泡時間對木質纖維素的去除和降解作用不同，因而導致產氣潛力不同。從日產氣量可以看出(圖5)，氨水浸泡時間越短，達到第2個產氣高峰的時間越短，如：氨水浸泡3 h在第11天達到第2個產氣高峰，而氨水浸泡9 h則在第13天達到第2個產氣高峰；而未處理組的日產氣量明顯低于氨水預處理組。經過氨水處理的實驗組累積沼氣產量明顯提高，為4 570～5 480 mL；與僅進行臭氧預處理實驗組相比，氨水預處理3、6、9 h的累積沼氣產量分別提高了148.6%、135.0%和181.7%。這表明氨水聯合預處理可以加強木質纖維素的降解，提高厭氧發酵的沼氣產量，從產氣量上看，9 h為最佳氨水浸泡時間。

2.2.3平均甲烷含量和甲烷產率

針對上述的沼氣產量分析，為了進一步對比臭氧氨水聯合預處理的效果，表3給出了不同預處理條件下的沼氣和甲烷產率。根據15 g稻秸的累積沼氣產量計算沼氣產率。可以觀察到臭氧用量越高，沼氣產率越高，為212.25～230.25 mL/g。而且臭氧預處理組的平均甲烷含量均高于對照組，從而導致臭氧用量越高，甲烷產率越高，在臭氧用量為1.5 g/g時，甲烷產率達154.08 mL/g。對于未經過氨水預處理實驗組的沼氣產率僅為97.25 mL/g，不同氨水浸泡時間下的沼氣產率為228.50～274.00 mL/g，提高了1.35～1.82倍，可見氨水預處理可有效提高稻秸的沼氣產率，這與其他探究結果相似，LI等[16]采用較優的氨預處理條件為51℃、14.8%氨水和27 h，沼氣產率提高了43.25%。從甲烷含量可以看出，氨水浸泡時間越長，甲烷含量越低。在臭氧用量1.0 g/g和氨水浸泡9 h的處理條件下所獲得的甲烷產率最高，為165.39 mL/g。

表3 臭氧氨水聯合預處理對沼氣和甲烷產率的影響Tab.3 Effect of ozone and ammonia pretreatment on biogas and methane yield

2.2.4結晶度變化

為揭示臭氧氨水聯合預處理對稻秸纖維素和半纖維素的降解機理，全過程的稻秸X射線晶體衍射圖如圖6所示(圖中θ表示衍射角)，包含了相應的衍射峰強度變化和計算后的結晶度變化。可以看出，原始稻秸的結晶度為31.69%，經過臭氧預處理后結晶度增加到37.30%，這是因為臭氧對非結晶區木質素的破壞[9]，從而導致結晶度升高，而且結晶區和非結晶區的衍射峰強度均減弱。當進行氨水預處理時，結晶度繼續升高，為50.09%，結晶區和非結晶區的衍射峰強度升高，這是由于在氨水預處理過程中非結晶區半纖維素和木質素含量降低，導致了結晶度大幅升高，可見臭氧預處理對增強氨水預處理的顯著作用，這個實驗結果與其他研究的氨水預處理增加結晶度的結論相一致[24]。在厭氧發酵后，盡管結晶度略高，但結晶區和非結晶區的衍射峰強度降到最低，分別為360 cps和254 cps，充分反映了稻秸在臭氧和氨水聯合預處理的充分降解特性。綜上，可見臭氧和氨水聯合預處理對稻秸中纖維結構的破壞及降解有著積極的作用，為后期甲烷乙醇聯產的應用提供了理論依據。

圖6 臭氧氨水聯合預處理過程中稻秸晶體衍射圖Fig.6 X-ray diffraction image of rice straw during ozone and aqueous ammonia pretreatment

3 結論

(1)臭氧氨水聯合預處理提高稻秸酶解糖化效率實驗結果表明，隨著臭氧用量的增加，葡萄糖質量濃度先增加后降低，0.75 g/g臭氧用量時葡萄糖質量濃度最高，為36.92 g/L；氨水浸泡時間越長，還原糖濃度越高，氨水浸泡6 h的還原糖質量濃度為60.51 g/L。臭氧氨水聯合預處理能明顯改善稻秸酶解糖化效率，適宜的臭氧氨水聯合預處理參數為臭氧用量0.75 g/g和氨水浸泡時間6 h。

(2)通過臭氧氨水聯合預處理提高厭氧發酵過程中沼氣和甲烷產率的實驗結果可知，隨臭氧用量增加，甲烷產率不斷增加；不同氨水浸泡時間下的沼氣產率為228.50～274.00 mL/g，而對于未經過氨水預處理實驗組的沼氣產率僅為97.25 mL/g。其中，臭氧用量1.0 g/g和氨水浸泡9 h獲得的甲烷產率最高，為165.39 mL/g。