嬰幼兒乳品中葉酸的微生物測定方法

商迎輝， 劉馨君， 黃漢昌， 勞鳳學

（北京市生物活性物質和功能食品重點實驗室/北京聯合大學 應用文理學院，北京 100083）

葉酸是一組化學結構相似、生化特征相近的化合物的統稱。由蝶啶、對氨基苯甲酸和1個或多個谷氨酸結合而成。葉酸是維持生物體正常生命過程所必需的一類有機物質，作為營養強化劑在某些食品中添加使用，以滿足特殊人群對葉酸的需求[1-7]。葉酸的分析方法很多，如果測定的是純葉酸制品或是藥品制劑中的葉酸含量，可采用比色法、高效液相色譜法、分光光度法、氣相色譜-質譜檢測法、熒光分析等測定方法[8-14]；如果對食品或保健食品中的游離葉酸、植物材料中的葉酸含量進行測定，最適合采用微生物法。20世紀60年代提出了葉酸微生物測定的方法，并逐漸得到完善，且微生物測定法具有靈敏度高，樣品處理簡單等特點[15-18]。GB 5413.16-2010規定了嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測定方法[19]，在實際檢測工作中發現依據該標準測定嬰幼兒乳品中葉酸含量時，含抗壞血酸的磷酸緩沖液對標準系列管中測試菌株的生長有影響，從而影響檢測結果。作者采用GB 5413.16-2010、GB/T 5009.211-2008及Biostest葉酸檢測試劑盒等不同方法，對同一乳制品樣品葉酸含量進行測定，同時做加標回收試驗，篩選影響顯著的因素，為嬰幼兒乳制品葉酸含量測定的微生物法的優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus：中國科學院微生物研究所提供；葉酸測定用培養基：美國BD公司產品；MRS肉湯培養基：北京陸橋技術有限責任公司產品；葉酸標準品：上海源葉生物科技有限公司產品；葉酸檢測試劑盒：美國Biostest產品。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外/可見光分光光度計：日本島津公司產品；Thermo Varioskan酶標儀：美國Thermo Scientific公司產品。

1.3 方法

1.3.1 參照GB 5413.16-2010嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測定[19]參照GB 5413.16-2010嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測定，對市售幼兒配方奶粉在重復性條件下進行5次獨立測試。

1）實驗用菌種及接種液的制備 將鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus菌種轉接至菌種儲備用MRS瓊脂培養基中，于（37±1）℃培養箱中培養16～24 h，連續傳代 2～3次，以增加細菌活力，提高細菌的靈敏度。試驗前一天，用接種環將培養了16～24 h的鼠李糖乳桿菌儲備菌種轉接至2支MRS培養液中，于（37±1） ℃培養箱中培養 16～20 h。無菌條件下離心，棄去上清液。用生理鹽水震蕩洗滌兩次并制成菌懸液，菌懸液吸光值為0.171。

2）樣品處理及樣品測定管制備 稱取混合均勻樣品2 g于100 mL燒杯中，用40 mL水復原樣品，轉入100 mL容量瓶中，用水定容至刻度。吸取1 mL樣液加入19 mL含抗壞血酸的磷酸緩沖液，于100℃水浴加熱5 min，冷卻后用含抗壞血酸的磷酸緩沖液定容至100 mL。同時制備加標樣品，加入葉酸標準品量為0.2 μg[20]。

取3支試管分別加入試樣提取稀釋液1、2、3 mL，補水至5.0 mL，加入5 mL葉酸測定用培養基。同樣制備加標樣品測試管。

3）標準工作液及標準系列管制備[21]制備葉酸標準儲備液（500 μg/mL）、葉酸標準中間液（50 μg/mL），用含抗壞血酸的磷酸緩沖液稀釋制備葉酸標準工作液（0.05、0.1 ng/mL）。

4）接種及測定 平行接種鼠李糖乳桿菌菌懸液到各樣品管和標準系列管，37℃培養60 h。用UV-2450紫外/可見光分光光度計，在波長550 nm下，以未接種標準管調零后，測定各管吸光度。

1.3.2 抗壞血酸的磷酸緩沖液對葉酸測定的影響葉酸含量相同但兩組含有抗壞血酸的磷酸緩沖液含量不同及葉酸含量相同但一組不含抗壞血酸的磷酸緩沖液進行實驗[19、22-23]。

1.3.3 參照GB/T 5009.211-2008對食品中葉酸的測 參照GB/T 5009.211-2008食品中葉酸的測定，對同一樣品市售幼兒配方奶粉在重復性條件下進行5次獨立測試定[19-22]。

1.3.4 使用Biostest葉酸檢測試劑盒對樣品中葉酸的測定 根據Biostest葉酸檢測試劑盒說明，對同一樣品進行5次重復測試，加標樣品加標量為0.2 μg。

1.4 數據分析

數據統計分析采用SPSS 19.0分析軟件，對3種不同測定方法測得的同一樣品中的葉酸含量進行單因素方差分析及多重比較。對在葉酸含量相同時，低質量濃度與高質量濃度葉酸標準工作液制備的標準系列管測得的OD值進行配對樣本t檢驗。對用含抗壞血酸的磷酸緩沖液和用水配制的葉酸標準工作液制備的標準系列管測得的OD值進行配對樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 參照GB 5413.16-2010的測定結果

2.1.1 標準系列管結果 葉酸質量濃度在0～0.5 ng/mL整個區間葉酸質量濃度與吸光值正相關較差，相關系數為0.882；但在 0～0.25 ng/mL區間，葉酸質量濃度與吸光值相關性較好，相關系數為0.988 4。原因在于在0～0.5 ng/mL整個區間葉酸質量濃度是逐漸增加的，但含有抗壞血酸的磷酸緩沖液的量不是漸增的，而在0～0.25 ng/mL區間，葉酸和含有抗壞血酸的磷酸緩沖液的量都是逐漸增加的。

圖1 葉酸質量濃度與吸光值關系Fig.1 Folic acid content and Absorbance value

2.1.2 樣品測定結果 對樣品和加標樣品分別作5次重復性測試，標準曲線方程為y=1.260 6x+0.085 8，R2=0.988 4（葉酸質量濃度在 0～0.25 ng/mL）。葉酸質量分數為（40.45±2.89） μg/hg，加標吸收率平均為71%。

2.2 抗壞血酸的磷酸緩沖液對葉酸測定影響的結果

2.2.1 含抗壞血酸的磷酸緩沖液 實驗結果見圖2，用SPSS 19.0數據軟件進行分析，采用配對樣本t檢驗，由P=0.024＜0.05（α=0.05）得，在葉酸質量濃度相同時，低質量濃度與高質量濃度葉酸標準工作液制備的標準系列管測得的A值存在顯著差異[2、5-6]。

圖2 低質量濃度和高質量濃度葉酸標準工作液的標準系列管吸光值及差值Fig.2 Absorbance value of low concentration and high concentration folic acid standard working liquid Standard tube and D-value

2.2.2 不含抗壞血酸的磷酸緩沖液 實驗結果見圖3。用SPSS 19.0數據軟件進行分析，采用配對樣本t檢驗，由P=0＜0.01（α=0.01）得，在葉酸質量濃度相同時，用含抗壞血酸的磷酸緩沖液和用水配制的葉酸標準工作液制備的標準系列管測得的A值存在極顯著差異。

圖3 用水和含抗壞血酸的磷酸緩沖液配制的標準工作液的標準系列管吸光值及差值Fig.3 Absorbance value of folic acid standard working liquid made up by ascorbic acid in phosphate buffe and water Standard tube and D-value

2.3 參照GB/T 5009.211-2008的測定結果

為避免含有抗壞血酸的磷酸緩沖液對測試結果的影響，參照GB/T 5009.211-2008食品中葉酸的測定，對參照GB 5413.16-2010測定過的市售幼兒配方奶粉進行5次重復性測試，同時做加標回收試驗，標準曲線見圖4。參照GB/T 5009.211-2008測定結果為葉酸質量分數（70.5±2.8）μg/hg，加標回收率平均為92.6%。

圖4 參照GB/T 5009.211-2008的標準曲線Fig.4 Standard curves consulted GB/T5009.211-2008

2.4 使用Biostest葉酸檢測試劑盒的葉酸質量分數測定結果

使用Biostest葉酸檢測試劑盒，對同一樣品進行5次重復測試，同時做加標回收試驗。標準曲線見圖5。參照葉酸檢測試劑盒測定結果為葉酸質量分數（73.7±4.0）μg/hg，加標回收率平均為99.0%。

2.5 3種測定方法測得的同一樣品中的葉酸含量的統計分析

方差同質性檢驗，在顯著性水平α=0.05時，p=0.636＞0.05，故方差齊性。用SPSS進行單因素方差分析，p=0＜0.01，3種不同測定方法存在極顯著差異。經LSD多重比較，參照GB 5413.16-2010嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測定測得的市售幼兒配方奶粉中葉酸含量與參照GB/T 5009.211-2008食品中葉酸的測定測試葉酸含量和使用Biostest葉酸檢測試劑盒測得的葉酸含量p=0＜0.01，存在極顯著差異。參照GB/T 5009.211-2008食品中葉酸的測定測得的葉酸含量與使用Biostest葉酸檢測試劑盒測得的葉酸含量p=0.142＞0.05，無顯著差異。

3 結語

微生物法測定葉酸受人員、設備、實驗材料、實驗方法、環境設施等多個環節影響，必須認真研究各個環節可能出現的問題，以保證測定方法的可行性[17]。按照GB 5413.16-2010嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測定，標準曲線在0～0.5 ng/mL整個區間，葉酸質量濃度與吸光值正相關較差，原因在于含抗壞血酸的磷酸緩沖液對測試有比較嚴重的影響。測試管的吸光值在一定范圍既與葉酸含量正相關同時也與含抗壞血酸的磷酸緩沖液量正相關。在標準測試管中因加入含抗壞血酸的磷酸緩沖液量的不同，不同程度的放大了葉酸的促進測試菌株生長的作用。

按照GB/T 5009.211-2008食品中葉酸的測定中，用水替代含抗壞血酸的磷酸緩沖液制備標準工作液，在0～0.5 ng/mL整個區間，葉酸質量濃度與吸光值正相關較好。使用Biostest葉酸檢測試劑盒時，隨葉酸測試培養基的加入，加入了等量的葉酸緩沖液，葉酸含量與吸光值正相關也較好。也可以進一步研究在標準系列管中加入相同量的含抗壞血酸的磷酸緩沖液或其它某種緩沖液，更好顯現葉酸含量與測試菌株生長的正相關性。

對市售幼兒配方奶粉進行測試，按照GB 5413.16-2010嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測定測得的結果遠低于其它兩種方法的測試結果，回收率也較低。作者認為按照GB 5413.16-2010嬰幼兒食品和乳品中葉酸的測定測試時，在標準測試管和樣品測試管加入含抗壞血酸的磷酸緩沖液的量是變化的，所以對測試產生了不確定的影響。