添加劑對溫濕生境青貯玉米發酵品質及有氧穩定性的影響

袁仕改， 陳 超， 張明均， 楊 豐， 申露露， 張滔滔， 郝 俊*

(1. 貴州大學動物科學學院， 貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省草地技術試驗推廣站， 貴州 貴陽 550025)

青貯飼料因其保存時間長、原料來源廣、內貯量大、適口性好等優點一直備受關注，尤其是利用添加劑改善青貯飼料發酵品質更是研究的熱點。玉米(ZeamaysL.)種植面積大，且籽實和秸稈產量高，是目前進行青貯的主要原料。生產中如果沒有嚴格控制青貯飼料在發酵貯藏過程中所需的厭氧環境以及在取用過程中未能妥善管理，容易發生二次發酵，導致青貯飼料營養水平大幅降低，青貯飼料發霉變質，從而降低動物生產性能和經濟效益。因此，如何有效地控制二次發酵對于保證青貯飼料的品質十分重要。使用添加劑可以改善青貯品質，提高飼料的適口性和有氧穩定性[1]。如劉禎等[2]在全株玉米青貯過程中添加劑乳酸菌，使二次發酵時間推遲了2 d左右；辛鵬程等[3]等認為，在青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook. f.)秸稈和多年生黑麥草(LoliumperenneL.)混合青貯中添加丙酸，添加0.4%以上的丙酸能夠改善混合青貯飼料的發酵品質和有氧穩定性。

然而，之前研究大多僅考慮添加劑對青貯品質和有氧穩定性的影響，卻忽略了環境條件的重要性。溫度和降雨是影響微生物總量和各類群微生物的關鍵氣候因子[4]，環境溫度和濕度的提高會促進有害微生物的生長和繁殖，如霉菌、梭狀芽胞桿菌和腸桿菌[5-7]。貴州屬于亞熱帶季風濕潤氣候，日照少，陰雨多，濕度大，夏季(6—8月)各月平均氣溫多在20～25℃，平均相對濕度在80%左右，最大的達85%[8]。青貯料暴露于這種溫暖潮濕的環境中更容易遭到破壞，進而加劇青貯飼料的二次發酵進程，而

在我國高寒地區高海拔、低溫和缺氧的極端環境中幾乎無二次發酵的現象[9]。本試驗以貴州本地玉米品種為研究對象，探索不同添加劑對溫濕生境全株玉米青貯飼料發酵品質及有氧穩定性的影響，同時采用模糊數學隸屬函數法對青貯飼料營養水平進行評價，綜合考慮發酵品質和有氧穩定性，篩選出該環境下適宜全株青貯玉米使用的添加劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在貴州省草地技術推廣站進行，屬于亞熱帶季風濕潤氣候，常年降水充沛，年均相對濕度80%左右，夏秋平均溫度20.6℃。青貯原料為蠟熟期全株玉米(營養成分見表1)，取自貴州省草地技術推廣站，品種名為德江本地，添加劑為食鹽(NaCl組)(云南省鹽業有限公司，NaCl≥98.5%)、丙酸(PA組)(成都科龍化工試劑廠，CH3CH2COOH，含量≥99.5%)、乳酸菌制劑(LAB組)[鄭州樂貝豐生物科技有限公司，布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、植物乳桿菌(Laobacillusplantarum)為主，活菌數≥108CFU·g-1]。

表1 青貯玉米原料特性(干物質基礎)Table 1 The characteristics of Zea mays L. material(DM basis)/%

注：CP：粗蛋白質；EE：粗脂肪；CF：粗纖維；Ash：粗灰分；WSC：水溶性碳水化合物；DM：干物質；下同

Note：CP：crude protein；EE：ether extract；CF：crude fiber；Ash：crude ash；WSC：water-soluble carbohydrate；DM：dry matter；The same as below

1.2 試驗設計

試驗采用單因素試驗設計，設4個試驗組，CK組：不加任何添加劑；LAB組：乳酸菌制劑(0.02 g·kg-1)；NaCl組：0.8%食鹽；PA組：0.5%丙酸。每個試驗組設置4個重復，每個重復約1 kg，添加量以原料鮮重為基礎，根據鮮重計算出所需添加劑的質量，將添加劑溶于50 ml蒸餾水中，均勻噴灑于1 kg青貯料，青貯時間為60 d。

1.3 青貯制作

2016年8月20日收獲蠟熟期全株玉米，用粉碎機將其粉碎至1～2 cm，不同處理組依照試驗設計使用不同添加劑，其中對照組噴灑等量蒸餾水，攪拌均勻后裝入青貯袋(28 cm×40 cm)，每袋裝料為1 kg左右，用抽真空機抽真空、密封，室內避光保存60 d后打開，進行感官評定和化學成分分析，同時評測有氧穩定性。青貯飼料保存期間平均溫度19.8℃，平均濕度為83%。

1.4 測定指標及方法

感官評價：采用德國農業協會(DLG)評分法，對飼料的顏色、氣味和結構進行打分，根據總分把飼料分為優良、尚好、中等和腐敗4個等級[10]；Ash：高溫灼燒法：稱取具有代表性試樣放入煅燒盤，先在電子爐上炭化，然后放入馬弗爐中，在550℃下灼燒4 h，殘渣占試樣百分比即為粗灰分含量；WSC：硫酸—蒽酮法：準確移取樣品液1 ml于試管中，立即加入5 ml硫酸—蒽酮溶液，搖勻，于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，在620 nm波長下比色測取吸光度值，根據標準曲線計算，得糖含量；CP：凱氏定氮法：在催化劑下，加濃硫酸消煮，使蛋白質和其它有機態氮都轉變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，用過量的硼酸液吸收，再以標準鹽酸滴定，根據酸的消耗量求出氮的含量，乘以換算系數6.25可計算出樣品中的CP含量；有機酸和pH：稱取青貯料30 g于具塞三角瓶中，加入270 ml去離子水，浸泡60 min后用攪拌機充分攪拌，4層紗布過濾得到浸提液，PHS-3C酸度計測定浸提液得到pH值，氣相色譜法測定有機酸含量[11]；EE：索氏提取法：樣品用脂溶性溶劑(本試驗使用石油醚)反復抽提，使全部脂肪除去，根據樣品和殘渣質量之差計算粗脂肪含量；中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)用范氏纖維法測定，具體操作參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[12]，鈣(Ca)按GB/T6436-2002、磷(P)按GB/T6437-2002進行分析測定。

1.5 營養水平綜合評定

運用模糊數學隸屬函數法對青貯飼料營養水平進行綜合評價，如果測定的指標與青貯飼料的營養水平成正相關，則用式(1)計算；如測定指標在某一最適值時，其營養水平最高，則該指標以最適值為標準，先計算測定值與標準值之間的絕對值，再求其倒數后用式(1)計算，本研究中，ADF和NDF依據最適值20.0%和27.5%[13]計算；如果是負相關，則用式(2)進行計算，計算公式為：

(1):R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；

(2):R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

公式中，R(Xi)為某指標隸屬函數值，Xi為該指標的測定值；Xmax為該指標最大值；Xmin為該指標最小值。然后對所有指標隸屬函數值進行相加，求其均值，以均值大小進行排名。

1.6 有氧穩定性測定

青貯發酵進行到60 d時，取150 g青貯料置于500 mL干凈的廣口瓶中，廣口瓶放置到絕緣隔熱的地方。在青貯物料的中心插入一個靈敏水銀溫度計測定溫度變化，同時監測室溫，從樣品接觸空氣到樣品溫度高于室溫2℃的時間(h)即有氧穩定持續的時間[14]。有氧暴露期間平均氣溫14.6℃，平均濕度81%。

1.7 數據分析

使用Microsoft Excel 2010軟件對基礎數據進行分析整理，結果用平均值±標準差表示(X±SD)，采用SPSS 22.0進行單因素方差分析單因子方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法對各組進行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵品質

感官評價結果見表2。由表2可知，感官評價得分最高的為LAB組(18分)，其余各組評價得分均為17分，不管是哪個處理組，其氣味、顏色和結構都表現較好，感官評價均為一級優良。

優質青貯飼料pH應當低于4.2，由表3可知，所有處理組均低于4.2，達到優質青貯飼料的標準，與感官評價結果相一致。

表2 玉米青貯飼料感官評價Table 2 Sensory evaluation of corn silage

注：表格內數值表示所得分值

Note：values in the table mean the score of sensory evaluation

表3 玉米青貯飼料pHTable 3 The pH value of corn silage

注：同行數據肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：values in the same row with different lowercase letter mean significant difference at the 0.05 level

由表4可知，所有處理組均未檢測出丁酸，乳酸含量最高的是LAB組，為21.77 mmol·L-1，但各處理組之間差異不顯著。根據青貯飼料有機酸含量及評分標準[15]進行打分(表4)，所有處理組有機酸評分均為滿分，與感官評定及pH情況一致。

表4 玉米青貯飼料有機酸含量及評分Table 4 Organic acid content and scores of corn silage

注：括號內為根據評分標準而得出的分數，同列數據肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Note：Scores in brackets are given according to organic acid content and scoring standard of silage，China. Values in the same column with different lowercase letter mean significant difference(P<0.05). The same as below

2.2 營養水平

由表5可知，經不同添加劑處理后，與對照處理組相比，全株玉米青貯飼料CP含量有所降低，其中PA組和LAB組顯著低于對照組(P<0.05)。但PA組EE含量最高，顯著高于其它處理組(P<0.05)。NDF和ADF均以LAB組為最高，顯著高于其它處理組(P<0.05)，WSC最高的是NaCl組，顯著高于除PA組外其它組(P<0.05)，Ash含量最高的是NaCl組，顯著高于其他組(P<0.05)，添加丙酸提高了Ca含量，顯著高于其余各組(P<0.05)，各組的P含量差異不顯著。

表5 玉米青貯飼料營養水平Table 5 Nutrition composition of corn silage/% DM

采用模糊數學隸屬函數法對不同處理組營養水平進行綜合評價(表6)，由表6可知，營養水平最好的是PA組，最差的是CK組，各組表現情況為：PA>LAB>NaCl>CK，其中LAB組和NaCl組營養水平均值非常接近，兩者差異可以忽略不計。

表6 玉米青貯飼料營養水平評價Table 6 Nutrition evaluation of corn silage

2.3 有氧穩定性

各處理組有氧穩定性如表7所示。由表7可知，CK組有氧穩定性最差，為24.5 h，顯著低于其他處理組(P<0.05)，最好的是PA組，為110.5 h，顯著高于除NaCl組之外其他組(P<0.05)。各處理組有氧穩定性優劣排名情況為：PA> NaCl >LAB>CK。

表7 玉米青貯飼料有氧穩定性Table 7 Aerobic stability of corn silage

3 討論與結論

本試驗中，LAB組感官評分最高，但不管是哪個試驗組，感官評價均為一級優良，這表明全株玉米青貯時，不使用添加劑也能得到感官較好的青貯料，與許慶方等[16]研究結果一致。pH是評價青貯飼料的重要指標，優質青貯料pH范圍為3.8～4.2[17]。本次試驗中，所有處理組pH均低于4.2，較為理想。添加乳酸菌對于pH的降低效果不顯著，與鐘書等[18]研究結果不完全一致，這是由于全株玉米本身WSC含量較高，可為青貯提供充足的發酵底物，不使用添加劑發酵品質也較好。有機酸總量及其構成可以反映青貯發酵過程的好壞，其中乳酸、乙酸和丁酸是評判的關鍵指標[19]。根據有機酸評分標準對各處理組進行打分，所有處理組均為滿分，表明各組發酵品質均較好。

使用添加劑可以改善青貯飼料的發酵品質或營養水平。采用模糊數學隸屬函數法對各組進行排名，各添加劑處理組營養水平均優于對照組，表明使用添加劑能提高全株玉米青貯料的營養水平，以PA組為最優。乳酸菌在本次試驗中提升效果不如丙酸，這是因為全株玉米青貯時不使用添加劑發酵品質已經較好，添加丙酸能抑制有害微生物的活動，較好保存原料的營養，且乳酸菌發酵需要消耗一定能量，所以相對于對照組提升效果不顯著。Henderson等[20]指出牧草的青貯特性、青貯飼料保存的環境條件和添加用乳酸菌的特性等是影響乳酸菌添加劑使用效果的主要因素，楊曉丹[21]在西藏地區制作葦狀羊茅(FestucaarundinaceaSchreb)青貯飼料時添加商品乳酸菌和本地分離得到的乳酸，發現本地分離得到的乳酸菌改善效果優于商品乳酸菌，所以未來研究的重點應放在如何從貴州本土材料中篩選合適的乳酸菌。

青貯飼料較高的有氧穩定性有利于降低二次發酵的幾率，減少飼料損失和家畜因采食發霉飼料而患病的風險。本試驗中，所有添加劑處理組均不同程度提高了青貯料的有氧穩定性，以PA組最好，為110.5 h，比CK組高出86 h，與Kung等[22]和陳雷等[23]研究報道相一致，這是因為丙酸是一種有效的抗真菌劑，對引起青貯飼料有氧腐敗的酵母菌和霉菌生長均有抑制作用。乳酸菌制劑是一種常見的微生物添加劑，其對青貯飼料有氧穩定性的影響報道不一致，Kung等[24]在大麥(HordeumvulgareL.)青貯中添加乳酸菌后，有效改善了大麥青貯飼料的有氧穩定性，但馬迪等[25]報道，在黑麥草青貯過程中添加鼠李糖乳桿菌會使青貯飼料傾向于好氧性變質。出現這種差異的原因可能與接種的乳酸菌類型有關，乳酸菌可分為同型發酵乳酸菌和異型發酵乳酸菌，同型發酵乳酸菌可有效改善青貯飼料的發酵品質，而一些異型發酵乳酸菌可明顯改善青貯飼料暴露于空氣后的有氧穩定性[26]。本次試驗中，LAB組的有氧穩定性比CK組高12 h，表明添加乳酸菌會增強青貯飼料的有氧穩定性，與呂文龍等[27]研究結果相類似，但效果不顯著，其可能原因是青貯原材料或環境溫度的改變，影響了乳酸菌的活性，故沒有完全發揮作用[28]，且本試驗所使用的乳酸菌制劑是混合菌劑，對青貯飼料的有氧腐敗抑制作用無單獨使用布氏乳桿菌強。塔娜等[29]研究報道布氏乳桿菌單獨或與同型發酵乳酸菌蒙氏腸球菌和植物乳桿菌聯合接種可有效抑制無芒雀麥(BromusinermisLeyss)青貯料的有氧腐敗，但前者更有效。食鹽一般被歸類為發酵抑制型添加劑，Cai等[30]在高粱(SorghumbicolorL. Moench)青貯詞料中添加食鹽，發現在發酵過程中食鹽能有效抑制需氧菌生長，但對酵母菌抑制不佳，李大鵬[31]報道加入一定的食鹽可改善靑貯詞料的品質，起到一定的防腐作用。本試驗中，NaCl組顯著提高了青貯飼料的有氧穩定性，相對于CK組，添加食鹽使有氧腐敗延遲了84 h，與瑪里蘭·畢克塔依爾等[32]的研究結果相類似。

綜上可知，全株玉米青貯時不使用添加劑也能獲得發酵品質較好的青貯料；綜合考慮發酵品質、營養水平和有氧穩定性，在貴州地區推薦使用丙酸用作全株玉米青貯添加劑。