益氣解毒中藥復方對急性電離輻射小鼠骨髓損傷的防護作用

徐文慧，李盼飛，王 磊，王 安，王天琪，高明澤，胡素敏

（北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029）

骨髓是人體重要的造血器官，對輻射高度敏感[1]，輻射導致的骨髓抑制主要表現為血細胞數減少、感染以及出血等急性損傷，其中以骨髓造血細胞損傷為最主要特征[2]。射線直接殺傷骨髓中的造血干細胞，骨髓組織中幼稚的紅、粒、巨核細胞大量死亡[3]，不能繼續生成血細胞，血細胞得不到補充，血細胞計數則會持續低下。電離輻射通過直接作用、間接作用對機體產生一系列損害，最終可引發細胞周期阻滯和細胞凋亡[4-5]，導致骨髓損傷，造血障礙，免疫功能低下等。本課題組前期研究發現，預防性給予以中藥為主要治法的中藥復方，可以提高受照后小鼠機體的免疫功能，從而在照后早期減少炎癥并發癥的發生[6]。而本文主要是研究該方對急性電離輻射小鼠骨髓損傷的防護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性Balb/c小鼠，體質量18～22 g，40只，由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，許可證號SCXK（京）2011-0004。飼養于環境溫度（20±2）℃，濕度50%±10%，按照12 h光照/12 h黑暗，自由攝食、飲水的飼養條件喂養，實驗前適應性飼養3 d。

1.2 實驗儀器 BD FASC antoII型流式細胞儀，美國BD公司產品；JY203電子天平，上海浦春計量儀器有限公司產品；冷藏冰箱、超低溫冰箱，海爾電器有限公司產品；5417R小型臺式高速離心機，德國Eppendorf公司產品；臺式冷凍離心機，湘儀檢測設備有限公司產品；MP5002型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品。THZ-D型臺式恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠產品。MK3型酶標儀，熱電（上海）科技儀器有限公司產品。搖床，其林貝爾儀器制造有限公司產品。

1.3 實驗試劑 PBS磷酸鹽（批號：No.529G021），北京索萊寶科技有限公司產品。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（批號：4293719）、FITC Rat Anti-Mouse CD34（批號：3331656）、PE Rat lgG2a k Isotype Control（批號：3130649）、FACS Lysing Solution（批號：3281668），美國BD公司產品。Mouse TNF-α Sunny ELISA Kit（批號：228251055），聯科生物技術有限公司產品。

1.4 藥物制作方法 中藥復方的中藥飲片均購自北京同仁堂藍色港灣店，經臨床中藥學教研室老師鑒定為真品，由本實驗室自行制備成水煎液。中藥復方煎煮2次，合并藥液，濃縮至原藥材的1～2 g/mL，60%乙醇除雜。給藥劑量為人臨床用量的10倍（即人臨床等效量），藥物濃度為 0.686 g/mL。鹽酸小檗胺片，由四川中方制藥有限公司提供，批號：150501。用去離子水溶解，給藥劑量為人臨床等效用量2.4 mg/mL。

1.5 動物分組、造模及給藥方法 小鼠在SPF級動物室中喂養3 d后，按照體質量隨機分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、小檗胺組、中藥組。正常組，灌胃去離子水，0.2 mL/10 g體質量；模型組，灌胃去離子水，0.2 mL/10 g體質量；小檗胺組，灌胃小檗胺水溶液，0.2 mL/10 g體質量；中藥組，灌胃相應藥液，0.2 mL/10 g體質量，均灌胃14 d。第14天灌胃后，除空白組小鼠外，其他各組小鼠進行一次性全身60Coγ射線照射，建立急性輻射損傷模型。照射采用北京大學化學與分子工程學院鈷源，將小鼠固定于帶氣孔的樹脂鼠籠中，對小鼠進行全身一次性60Coγ射線照射，照射劑量為3.5 Gy，照射劑量率為0.455 Gy/min。各組照射后不再灌胃給去離子水或藥物，照射后第4天取材。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 外周血細胞計數 小鼠摘眼球取全血80 μL，用EDTA-K2抗凝，于全自動血細胞分析儀檢測外周血細胞數，包括白細胞數（WBC）、紅細胞數（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、血小板數（PLT）。

1.6.2 骨髓組織病理檢查 每組取6只小鼠胸骨，置于10%中性福爾馬林中固定24 h后，浸泡在脫鈣液中脫鈣，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備4 μm石蠟切片，60℃烘箱烤片，HE染色。然后在顯微鏡下觀察骨髓造血組織病理變化。

1.6.3 骨髓CD34+細胞檢測 每組選取6只小鼠，分別剝取股骨，用注射器套上的7號針頭吸取1 mL的PBS液反復沖洗骨髓，將骨髓細胞沖入1.5 mL離心管中離心，離心條件為300×g，4℃，5 min。去上清，加PBS液至0.5 mL，混勻，制備成單個骨髓細胞懸液。取120 μL骨髓細胞混懸液，加入CD34抗體3 μL抗體，室溫下避光反應15 min。加入1 mL 1?的紅細胞裂解液，混勻，裂解10 min，直至透亮，室溫離心300×g，5 min。吸去950 μL上清，加入1 mL PBS，混勻，室溫離心300×g，5 min。加200 μL PBS后流式細胞儀檢測。

1.6.4 骨髓細胞周期檢測 取上述骨髓細胞混懸液180 μL，加上420 μL的冰冷的無水乙醇固定。加冰冷的0.6 mL PBS，離心300×g、4℃、5 min，去上清，加1 mL PBS，離心300×g，4℃、5 min，去上清。加200 μL PBS，加RNA酶A（1 mg/mL）至終濃度為50 μg/mL，37 ℃孵育40 min，加入PI至終濃度為20 μg/mL（約5 μL），5 min后流式細胞儀檢測。1.6.5 骨髓細胞凋亡檢測 將1.6.3的骨髓細胞混懸液 120 μL，加入 1 ? Binding Buffer 100 μL，混勻。加入3 μL FITC，輕輕吹打，室溫避光孵育15 min。加入3 μL PI，立即避光，流式細胞儀檢測，上機前再加入 100 μL 1 ? Binding Buffer。

1.6.6 外周血TNF-α檢測 取小鼠血清，按照ELISA試劑盒說明檢測血清中TNF-α含量。

1.7 數據分析 實驗結果以均數±標準差（x± s ）進行統計描述，采用 SPSS 17.0 統計軟件進行分析。組間比較用獨立樣本的t檢驗。對于本實驗指標如白細胞數等，正常組與各照射組數據相差很大，在比較時采用正常組與模型組比較，確定模型是否成功，然后單因素方差比較統計各照射組組間差異。所有的統計檢驗均采用雙側檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血細胞計數 照射后4 d，與空白組比較，模型組小鼠外周血白細胞數、紅細胞數及血紅蛋白濃度均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.001）。與模型組相比，小檗胺組外周血紅細胞數顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），中藥組白細胞數、紅細胞數及血紅蛋白濃度升高，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 小鼠外周血細胞計數（x± s ，n = 10）

2.2 骨髓組織病理檢查 正常組胸骨骨髓增生活躍，紅系、粒系、巨核系造血干細胞明顯。模型組胸骨骨髓增生低下，三系造血干細胞明顯減少，血管擴張、充血，脂肪細胞增多，骨髓脂肪化明顯，血管大量出血。小檗胺組胸骨骨髓增生低下，三系造血干細胞明顯減少，血管擴張、充血，脂肪細胞增多，骨髓脂肪化明顯，血管大量出血，較模型組稍好。中藥組胸骨骨髓增生稍有低下，三系造血干細胞明顯，骨髓稍有脂肪化，較模型組有明顯改善，好于模型組。見圖1（見插頁一）。

2.3 骨髓CD34+細胞檢測 照射后4 d，與空白組比較，模型組小鼠骨髓CD34+細胞比率有降低趨勢。預給藥干預后，小檗胺組、中藥組骨髓CD34+細胞比率較模型組有增多趨勢，差異無統計學意義。見表2，圖2（見插頁一）。

2.4 骨髓細胞周期檢測 見表3，圖3（見插頁一）。結果顯示，照后后4 d，與空白組相比，模型組 G0/G1期細胞比例降低，而 S 期細胞比例升高，G2/M期細胞比例減少，提示照射后4 d引起小鼠骨髓干細胞發生S期延遲。與模型組相比，小檗胺組、中藥組 G0/G1期細胞比例有升高的趨勢，S期細胞比例有降低趨勢，G2/M期細胞比例有升高趨勢。

2.5 骨髓細胞凋亡檢測 照射后4 d，與空白組比較，模型組、小檗胺組、中藥組小鼠骨髓細胞早期、晚期、總凋亡率均升高，預給藥干預后，小檗胺、中藥復方有減少骨髓細胞凋亡的作用趨勢，但不具有顯著性差異。見表4。

表2 CD34+細胞比率（x± s ，n = 6）

表3 小鼠骨髓細胞周期（x± s ，n = 6） %

表4 小鼠骨髓細胞凋亡（x± s ，n = 6）

2.6 外周血TNF-α檢測 照射后4 d，與空白組比較，模型組外周血TNF-α明顯升高（P＜0.05）， 預給藥干預后，小檗胺、中藥組小鼠均有使外周血TNF-α降低的趨勢，其中中藥方能明顯降低小鼠外周血TNF-α水平，有顯著統計學意義（P＜0.001）。

表5 小鼠外周血TNF-α含量（x± s ，n = 10） pg/mL

3 討論

骨髓是機體對電離輻射高度敏感的器官之一[7]，電離輻射發生后，其突出的不良反應是骨髓抑制及白細胞減少[8]。輻射導致骨髓造血功能嚴重受損，造血細胞有絲分裂停止，細胞更新中斷，反映在外周血象中則表現為白細胞、紅細胞數量迅速下降和血紅蛋白濃度的降低，其中白細胞對射線高度敏感。故外周血細胞計數可反映骨髓的造血功能[9]，白細胞數量的改變能夠反映輻射損傷的嚴重程度[10]。

CD34抗原是一種階段特異性白細胞分化抗原[11]，陽性表達于造血干細胞和祖細胞表面[12]，正常人骨髓低密度單個核細胞中CD34+細胞約占1.5%[13]，并隨著骨髓干細胞的分化成熟而逐漸減少直至消失[114]。小鼠骨髓中CD34+細胞的比例,可反映骨髓中造血干祖細胞的數量[15]。

電離輻射通過誘導細胞周期G1期阻滯、G2期阻滯、S 期延遲及S/M解偶聯，從而影響細胞周期進程[4]。機體內有一系列的適應機制保護細胞免受損傷，多種有害刺激如射線，可以打破氧化應激的平衡狀態，促使細胞凋亡甚至導致病理損傷[16]。骨髓中分裂增生能力旺盛的造血干祖細胞受到輻射后發生細胞周期阻滯，這是機體對外界刺激的一種保護性反應，此時可提供充足的時間對輻射損傷的DNA進行修復，但損傷嚴重者通過G1期永久性阻滯或被誘導凋亡而清除掉。

造血干祖細胞的增殖分化受到體液因子的調控，負向調控的因子對造血干祖細的增殖分化有不同程度的抑制作用[17]。輻射損傷促進了負調控因子TNF-α的表達，使之對造血系統產生負性調控，抑制造血細胞增殖，誘導細胞凋亡[17-18]。TNF-α主要由活化的巨噬細胞、NK細胞及T淋巴細胞產生，具有免疫調節作用[19]。有報道顯示，輻射可誘導腫瘤壞死因子α（TNF-α）的過度表達，而TNF-α又可影響骨髓微環境，誘導骨髓細胞凋亡[20]。

本研究表明，中藥復方能顯著升高白細胞數、紅細胞數及血紅蛋白濃度，同時病理切片顯示出對骨髓損傷的保護作用，說明中藥復方能夠有效的防護電離輻射所致的骨髓損傷。輻射后負向調控因子如TNF-α的過度表達加劇了骨髓抑制，而照射前小鼠灌胃益氣解毒中藥復方，結果顯示能夠很好的防護骨髓，其中的機制之一可能是通過降低外周血中TNF-α水平對抗其對骨髓造血功能的負性調控。中藥復方對照射后第4天小鼠骨髓的細胞周期和細胞凋亡影響不明顯，CD34+細胞百分比也未見統計學差異，說明在中藥復方雖然對輻射所致的骨髓損傷有一定的防護作用，但是照射后第4 天的實驗結果還不能支持其防護機制是通過延緩骨髓細胞周期阻滯，降低細胞凋亡率來實現的，其中深入的機制還需進一步探索。