HLA-G陽性的胎盤間充質干細胞對NK細胞殺傷功能的影響

崔桂玉 白劍 苗蘭英 林大勇 劉鴻

1內蒙古民族大學醫學院（內蒙古通遼028000）；2遼寧中醫藥大學（沈陽 110847）

胎盤間充質干細胞是成體干細胞的一種，由于其具有低免疫原性、來源廣泛和免疫抑制的特點，目前已經應用于臨床治療缺血性疾病和預防移植物抗宿主病等［1-2]。由于體內免疫系統存在使得外源性輸入的胎盤間充質干細胞很快的被淋巴細胞識別、殺傷，這些因素直接導致胎盤間充質干細胞在體內存活的時間和數量減少［3]。人類白細胞抗原-G（human leucocyte antigen-G，HLA-G）屬于非經典的HLAⅠ類分子，在孕婦體內表達較高，其主要功能是誘導母嬰耐受，近年來的研究表明HLA-G對于自然殺傷淋巴細胞（natural killer lymphocyte，NK）、CD4+T淋巴細胞和B淋巴細胞具有抑制作用［4-5]。HLA-G可以直接與NK與KIR2DL4受體相互作用，阻斷MAPK和DNA-PKcs信號通路，抑制NK殺傷活性［6]。胎盤間充質干細胞能夠表達HLA-G，孕酮可以調節HLA-G表達強度，在一定程度上增強胎盤間充質干細胞的免疫抑制功能，但是HLA-G表達與孕酮的濃度呈現計量依賴性，當孕酮消失后HLA-G表也隨之降低并逐步消失［4，7]。外源性的轉染 HLA-G 基因可以持續的表達該蛋白，有效的增強胎盤間充質干細胞的免疫抑制功能，將HLA-G陽性的胎盤間充質干細胞與NK細胞混合培養，檢測NK細胞對HLA-G陽性的胎盤間充質干細胞殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料NK92mi細胞株和NK92mi培養基（北京鼎國昌盛生物科技有限公司）；DMEM/DF12培養基和PBS（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（普洛麥格北京生物技術有限公司）；單克隆抗體CD45-Percp/CD34-PE/HLA-DR-FITC/CD29-PE/CD44-FITC/CD105-APC（美國BD公司）；PEGFP-N1-HLA-G全基因合成質粒（北京奧科鼎盛生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；HLA-G特異性單抗4H84和α-Tublin（Santa Cruz公司）；二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher公司）；0.25%胰酶（美國Sigma公司）；550酶標儀（美國Bio-Rad公司）；蛋白電泳及電轉移裝置（美國Bio-Rad公司）。

足月新生兒胎盤取自于遼寧中醫藥大學附屬醫院，取得父母知情同意書后，經本院倫理委員會討論通過用以制備胎盤間充質干細胞。

1.2 方法

1.2.1 胎盤間充質干細胞的分離培養及鑒定將胎盤表面用75%的酒精消毒后，并用生理鹽水反復沖洗3次。將胎盤在超凈工作臺中用眼科剪刀將胎盤剪成大小約為1～2 mm2的碎塊，放入50 mL的離心管中，用生理鹽水沖洗后離心直至離心管中的生理鹽水澄清為止。經過在1 500 r/min離心5 min后棄去上清液，加入含0.25%胰酶和0.1膠原酶Ⅳ的生理鹽水30 mL并放置于培養箱中30 min，使得酶在37℃能夠充分的發揮活性。用100目的濾網過濾胎盤碎塊，將過濾液體放入15 mL離心管中收集，并在1 500 r/min離心5 min后棄去生理鹽水，在離心后的細胞沉淀中加入10%胎牛血清的DMEM/DF12培養基充分混勻并轉移至培養瓶中。待細胞貼壁后生長至融合度90%左右時用0.25%的胰酶將細胞消化按照1∶3接種于新的培養瓶中。當傳代后的細胞進入指數生長期后，將細胞消化制備單細胞懸液并調整濃度至1×106個/mL，取200μL細胞懸液，分別加入CD45-Percp/CD34-PE/HLA-DR-FITC/CD29-PE/CD44-FITC/CD105-APC流式抗體各5μL，避光室溫孵育20 min后流式細胞儀上檢測。

1.2.2 胎盤間充質干細胞轉染HLA-G基因及鑒定將指數生長期的胎盤間充質干細胞2×105個接種到6孔板內，加入10%胎牛血清的DMEM/DF12培養基3 mL，待細胞融合度達到80%左右進行轉染。分別取LipofectamineTM2000試劑1.5μL與PEGFP-N1-HLA-G及空載體PEGFP-N1各0.5μg用DMEM/F12稀釋到200μL，將混合后的LipofectamineTM2000室溫放置30 min。棄去6孔板內含血清的DMEM/F12培養基并用PBS沖洗細胞2次，并在每一孔中加入1 000μL無血清DMEM/F12培養基，之后將200μL混有PEGFP-N1-HLA-G及空載體PEGFP-N1的LipofectamineTM2000的DMEM/F12分別滴入6孔板內，在二氧化碳培養箱內孵育4 h后棄去轉染液，加入含有10%胎牛血清的DMEM/DF12培養基3 mL在培養箱內繼續培養20 h。

收集6孔板中轉染后的胎盤間充質干細胞，通過蛋白裂解液裂解后，收集到1.5 mL EP管中，煮沸5 min后12 000 r/min離心1 min，棄上清備用。BCA法進行蛋白定量，向SDS-PAGE凝膠中加入樣本，電泳分離后電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜。加入HLA-G（1∶1 000）和α-Tublin（1∶1 000）抗體4℃孵育過夜后，加入二抗37℃孵育30 min。采用凝膠成像分析系統檢測各條帶的吸光度值并計算蛋白的相對表達量。

1.2.3 NK細胞殺傷性實驗將胎盤間充質干細胞、轉染空載體PEGFP-N1的胎盤間充質干細胞及轉染PEGFP-N1-HLA-G的胎盤間充質干細胞計數，按照每孔1 000個細胞接種于96孔板內，每組設置5個復孔，待細胞貼壁后吸取上清液，按照NK-92mi細胞與實驗效應細胞10∶1的比例在96孔板內的每一個孔中加入10 000個NK-92mi，并混合培養4 h。同時設置一組無細胞的上清液組作為空白對照組，用于計算細胞的殺傷率。按照CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒說明書進行，將培養基與細胞裂解液體積比10∶1加入上述96孔板中，在重力加速度為250×g情況下離心4 min，取出CytoTox 96的每一孔中加入50μL裂解后的上清液，室溫下靜置避光30 min，后加入終止液，用酶標儀在490 nm波段檢測光密度值。細胞的溶解率計算公式為溶解率=（對照組光密度值-實驗組光密度值-空白對照組光密度值）/（對照組光密度值-空白對照組光密度值）×100%。

1.3 統計學方法采用SPSS 16.5統計軟件。符合正態分布的計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，組間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胎盤間充質干細胞的表面分子的鑒定第二代胎盤間充質干細胞通過流式細胞檢測干細胞標記物，其中CD45、CD34和HLA-DR呈陰性表達，CD29、CD44和CD105呈陽性表達。其中CD29陽性表達率為98.1%，CD44陽性表達率為99.3%，CD105陽性表達率為98.9%（圖1）。

圖1 胎盤間充質干細胞表面受體表達Fig.1 Receptor expression on placenta-derived mesenchymal stem cells

2.2 胎盤間充質干細胞轉染HLA-G基因的鑒定空白對照組中HLA-G蛋白的相對表達量為PEGFP-N1-HLA-G轉染組的（0.23±0.05）倍，空白對照組與PEGFP-N1-HLA-G組相比結果差異有統計學意義（P＜0.01）；PEGFP-N1轉染組中HLA-G蛋白的相對表達量為PEGFP-N1-HLA-G轉染組的（0.27± 0.03）倍，PEGFP-N1轉染組與PEGFP-N1-HLA-G組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

2.3 NK細胞殺傷性實驗經過試劑盒檢測后，胎盤間充質干細胞的細胞溶解率（67.53±3.57）%，轉染空載體PEGFP-N1的胎盤間充質干細胞的細胞溶解率（69.13±4.11）%，轉染PEGFP-N1-HLA-G的胎盤間充質干細胞的細胞溶解率（51.22±3.87）%，轉染PEGFP-N1-HLA-G的胎盤間充質干細胞組與胎盤間充質干細胞組相比差異有顯著性（P＜0.05、圖3）。

3 討論

圖2 對照組、PEGFP-N1組和PEGFP-N1-HLA-G組中HLAG表達Fig.2 HLA-Gexpression on placenta-derived mesenchymal stem cells in control group，PEGFP-N1group，PEGFP-N1-HLA-Ggroup

圖3 對照組、PEGFP-N1組和PEGFP-N1-HLA-G組中細胞的溶解率Fig.3 Dissolution rate of cells in control group，PEGFP-N1 group，PEGFP-N1-HLA-Ggroup

胎盤間充質干細胞容易獲得，且增殖速度快，免疫原性低，目前已經廣泛應用于移植排斥和自身免疫性疾病，是目前最具前景的間充質干細胞之一。胎盤間充質干細胞存活率是影響其應用的重要因素之一，目前對胎盤間充質干細胞在體內的清除過程仍然不明，可能與宿主對外源性細胞的清楚和胎盤間充質干細胞代謝周期有關。HLA-G是具有免疫抑制功能的蛋白，在器官移植受者體內和孕婦體內均能檢出，HLA-G的表達使得胎盤間充質干細胞增強免疫抑制功能，并通過抑制NK細胞表面受體KIR2DL4增加在在受者體內的存活時間和數量。有研究顯示，HLA-G可以通過孕酮的調節增強胎盤間充質干細胞表面的表達，并且與孕酮的濃度呈現計量依賴性，當孕酮消失后HLA-G表也隨之降低并逐步消失［8-10]。通過轉染的方式可以使得胎盤間充質干細胞獲得持續高表達的HLA-G，從而增強HLA-G陽性的胎盤間充質干細胞的免疫抑制功能［4]。

目前，胎盤間充質干細胞在臨床的治療以雙向免疫調節為主，即存在免疫增強作用也存在著免疫抑制作用，因此在自身免疫病、缺血性疾病、器官移植等多個領域均有應用［11]。如果有效增強胎盤間充質干細胞在受者體內的存活數量和時間，就可以增強胎盤間充質干細胞在受者體的功能。因此本次實驗在此基礎上，通過外源性的對胎盤間充質干細胞修飾HLA-G蛋白，檢測HLA-G陽性的胎盤間充質干細胞是否可以逃避NK細胞的殺傷。結果表明，胎盤間充質干細胞的細胞溶解率（67.53±3.57）%而轉染PEGFP-N1-HLA-G的胎盤間充質干細胞的細胞溶解率（51.22±3.87）%，這提示HLA-G抗原可作為免疫耐受分子，直接參與抑制NK細胞的免疫功能，對于提高胎盤間充質干細胞存活率有明確作用。但本實驗目前僅局限于體外實驗，體內試驗是否有類似的結果仍然待于進一步觀察。