Smac/DIABLO在子宮內膜癌中的表達及促凋亡機制

王曉華 張玉娟

承德醫學院附屬醫院婦科（河北承德 067000）

子宮內膜癌發病率逐年上升，呈現出年輕化趨勢［1]。子宮內膜癌的發生、發展是一個多階段、多基因調控異常的過程，尋找與其密切相關的特異性分子標志物，對內膜癌患者進行早期診斷、早期治療，成為婦科腫瘤領域的研究熱點。Smac/DIABLO又稱為低等電位點的凋亡抑制蛋白的直接結合蛋白，位于12號染色體長臂，由7個外顯子組成。目前研究發現［2-5]Smac/DIABLO的表達和多種腫瘤的進展呈明顯負相關，而Smac/DIABLO在子宮內膜癌發生、發展中的作用及其機制鮮有報道。本研究通過檢測Smac/DIABLO在不同子宮內膜組織中的表達，研究Smac/DIABLO在子宮內膜癌發生、發展中的作用，并通過構建過表達Smac/DIABLO的Ishikawa細胞模型，檢測相關蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的表達，探討Smac/DIABLO在子宮內膜癌中發揮作用的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2014年12月至2016年3月承德醫學院附屬醫院行手術治療的子宮內膜癌患者新鮮內膜組織共46例，依據手術病理分期（FIGO，2009年）其中Ⅰ期28例、Ⅱ期12例、Ⅲ期6例，有淋巴結轉移8例、無淋巴結轉移38例，高分化34例、中分化8例、低分化4例，均獲得病理學確診為子宮內膜樣腺癌。同期收集新鮮正常內膜組織30例，非典型增生內膜組織24例。標本離體后迅速放入液氮中，再轉至-80℃冰箱保存。患者年齡為40～65歲，平均（55.2±6.7）歲，術前均未接受放化療及激素治療。所有標本收集均經倫理委員會同意，簽署患者知情同意書。

1.2 主要材料及試劑子宮內膜高分化腺癌Ishikawa細胞購自南京凱基公司，胎牛血清（FBS）、PRMI 1640培養基購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，Trizol購自美國Ambion公司，RT-PCR逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen公司，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自聯科生物公司，Smac/DIABLO、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9兔單克隆抗體，β-actin鼠多克隆抗體購自英國abcam公司。

1.3 qRT-PCR檢測Smac/DIABLO mRNA表達Triol法提取各組總RNA，以1μL RNA為模板，根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA第1條鏈，應用熒光定量試劑盒進行qRT-PCR反應。Smac/DIABLO和GAPDH引物序列由大連寶生物公司設計合成，Smac/DIABLO上游引物序列5′-CGCAGATCAGGCCTCTATAACC-3′，下游 5′-CCCCTTCCTCCTGTGTTTTCT-3′，擴增產物149 bp；GAPDH上游引物序列 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴增產物 138 bp。反應條件：95℃ 3 min 1循環，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃30 s共35循環。用2-△△ct方法計算目的基因Smac/DIABLOmRNA相對表達量。

1.4 細胞培養及轉染Smac/DIABLO的過表達質粒pcDNA3.1-Smac和空載體對照質粒由蘇州吉瑪公司構建。Ishikawa細胞培養在含10%FBS的PRMI 1640培養基中，轉染前24 h將細胞均勻接種于6孔板，密度為4×105個/mL。按Lipofectamine 2000說明書配制轉染試劑。實驗分為過表達組、空載體對照組和空白對照組，過表達組轉染pcDNA3.1-Smac過表達質粒，空載體對照組轉染Smac空載體對照質粒，空白對照組加入10%FBS。轉染24 h后熒光顯微鏡下觀察并計算轉染效率。

1.5 Western blot檢測Smac/DIABLO、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達轉染后48 h，將細胞加入RIPA充分裂解后離心，取上清液進行BCA蛋白定量。蛋白變性后取40μg進行凝膠電泳，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（1∶1 000）4℃過夜，二抗（1∶3 000）孵育1 h。ECL超敏化學發光液顯影，采用Tanon 6100化學發光圖像分析系統進行成像并進行定量分析，目的蛋白Smac/DIABLO與內參蛋白β-actin的光密度比值，計算目的蛋白的相對表達量。

1.6 統計學方法應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料用表示，采用單因素方差分析和兩獨立樣本t檢驗，多組數據間比較釆用q檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組Smac/DIABLO mRNA表達3組患者年齡、血壓和體質指數比較差異無顯著性（P＞0.05）。子宮內膜癌組、非典型增生組和正常內膜組，Smac/DIABLO mRNA相對表達量分別為0.325±0.024、0.792±0.064、1.000±0.000，子宮內膜癌組Smac/DIABLO mRNA相對表達量明顯低于非典型增生組和正常內膜組，經單因素方差分析，差異具有統計學意義（F=162.493，P=0.007）。

2.2 Smac/DIABLO mRNA表達與子宮內膜癌臨床病理參數的關系子宮內膜癌組織中Smac/DIABLO mRNA的表達與FIGO分期、淋巴結轉移及肌層浸潤深度有關（P＜0.05），與年齡、組織分化程度無關（P＞0.05）。FIGO分期越高、肌層浸潤程度越深、淋巴結轉移陽性，Smac/DIABLOmRNA表達量越低。見表1。

表1 Smac/DIABLOmRNA的表達與子宮內膜癌臨床病理參數的關系Tab.1 Relationship between Smac/DIABLOmRNAexpression and clinicopathological parameters of endometrial±s

表1 Smac/DIABLOmRNA的表達與子宮內膜癌臨床病理參數的關系Tab.1 Relationship between Smac/DIABLOmRNAexpression and clinicopathological parameters of endometrial±s

參數年齡（歲）≤60＞60肌層浸潤深度＜1/2≥1/2組織分化程度高分化中+低分化FIGO分期Ⅰ+ⅡⅢ淋巴結轉移有 無例數34 12 32 14 38 8 40 6 8 3 8 Smac/DIABLOmRNA相對表達量0.314±0.012 0.336±0.016 0.392±0.009 0.227±0.011 0.368±0.013 0.398±0.015 0.296±0.004 0.215±0.007 0.194±0.006 0.324±0.011 t值0.382 1.425 0.576 1.798 5.623 P值0.625 0.023 0.814 0.006 0.018

2.3 轉染效率檢測轉染24 h后，熒光顯微鏡下觀察細胞內強弱不等的綠色熒光，分別拍攝同一明暗視野下的細胞圖片，根據轉染效率（%）=暗視野綠色熒光細胞數/明視野細胞數，計算得出轉染效率約為80%。見圖1。

圖1 細胞轉染圖（×200）Fig.1 Cell transfection map（× 200）

2.4 轉染后Smac/DIABLO蛋白表達過表達組、空載體對照組和空白對照組Smac/DIABLO蛋白相對表達量分別為0.628±0.011、0.264±0.007、0.242±0.004，過表達組Smac/DIABLO蛋白相對表達量明顯增加，經單因素方差分析，差異具有統計學意義（F=85.628，P=0.008）。說明轉染Smac/DIABLO過表達質粒，可增強Smac/DIABLO在Ishikawa細胞中的表達。

2.5 轉染后相關蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9表達過表達組Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白相對表達量比較空載體對照組和空白對照組明顯增加，經單因素方差分析，差異具有統計學意義（P＜0.01，P＞0.05）。見圖2、表2。

圖2 轉染后各組Caspase-3,7,9蛋白條帶圖Fig.2 Caspase-3,7,9 protein bands in each group after transfection

表2 轉染后各組Caspase-3，7，9蛋白相對表達量Tab.2 The relative expression of Caspase-3，7，9 protein in each group after transfection（n=6）±s

表2 轉染后各組Caspase-3，7，9蛋白相對表達量Tab.2 The relative expression of Caspase-3，7，9 protein in each group after transfection（n=6）±s

組別過表達組空載體對照組空白對照組F值P值Caspase-3 0.664±0.012 0.375±0.007 0.392±0.004 42.640 0.006 Caspase-7 0.428±0.005 0.247±0.003 0.269±0.007 108.452 0.002 Caspase-9 1.228±0.027 0.824±0.012 0.896±0.016 179.265 0.018

3 討論

人類Smac/DIABLO基因在腫瘤的發生、發展過程中發揮了重要作用。XUE等［6]研究發現，Smac/DIABLO在乳腺癌組織中的表達明顯低于乳腺纖維瘤組織。THORSTEN等［7]研究發現，Smac/DIABLO在膀胱癌患者中的表達僅為正常人的1/2，并且Smac/DIABLO高表達組患者的五年生存率明顯高于低表達組。同樣Smac/DIABLO在腎癌［8]、胰腺癌［9]、卵巢癌［10]中的表達量較正常組織均明顯減低。本研究發現，Smac/DIABLO mRNA在子宮內膜癌中的表達明顯低于非典型增生組和正常內膜組（P＜0.01）。Smac/DIABLO在子宮內膜癌組織中的表達與FIGO分期、淋巴結轉移及肌層浸潤深度有關（P＜0.05），FIGO分期越高、肌層浸潤程度越深、淋巴結轉移陽性，Smac/DIABLOmRNA表達量越低，與年齡和組織分化程度無明顯相關性（P＞0.05）。

腫瘤的發生與細胞凋亡受阻有關，細胞凋亡受阻有利于轉化突變的細胞發生積聚性生長，使細胞生存期延長［11]。細胞凋亡存在內源性和外源性兩條通路，分別稱為線粒體介導通路和死亡受體介導通路。含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteine aspartic acic specitic protease，Caspase）家族作為細胞凋亡的主要執行者，在不同的凋亡通路發揮作用。其中Caspase-3和Caspase-7是線粒體介導通路和死亡受體介導通路共同的天冬氨酸特異性蛋白酶，Caspase-9是線粒體介導通路的始動因子［12]。Smac/DIABLO可與凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的桿狀病毒IAP重復區（baculoviral IAP repeat，BIR）結合，消除 IAPs對 Caspase的抑制作用，達到抑制細胞增殖、促進凋亡的作用［13-14]。本研究應用脂質體法將Smac/DIABLO的過表達質粒pcDNA3.1-Smac轉染人子宮內膜癌Ishikawa細胞，熒光顯微鏡下觀察計算轉染效率約80%，轉染后過表達組Smac/DIABLO蛋白相對表達量明顯增加（P＜0.01），說明過表達Smac/DIABLO的Ishikawa細胞模型構建成功。Western blot結果顯示，轉染后Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達量均明顯增加（P＜0.05），說明Smac/DIABLO可能在線粒體介導通路和死亡受體介導通路兩條途徑發揮作用，解除IAPs對Caspase的抑制作用，促進細胞凋亡。

綜上所述，Smac/DIABLO與子宮內膜癌的發生、發展呈負相關，推測其通過內源性和外源性兩條凋亡通路發揮作用，可為子宮內膜癌的預后判斷及治療提供新的靶點。但細胞凋亡是多通路、多基因共同作用的結果，Smac/DIABLO發揮作用的具體機制尚不明確，還需對Smac/DIABLO及凋亡通路相關基因進一步深入研究。