Endophilin A2通過調節PTEN/Akt通路對心肌細胞急性缺血損傷的影響

沈煥嘉 莫沁杏 陳玉柳 劉蕓

廣州醫科大學藥學院藥理教研室（廣州 511436）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種發病率和致死率較高的缺血性心臟病，表現為持續缺血缺氧，從而導致心肌細胞損傷和左室重構，嚴重時可導致心衰，是嚴重危害公眾健康的心血管疾?。?]。其中心肌細胞凋亡是導致心肌細胞死亡的重要原因之一［2-3]。在AMI過程中，炎癥反應和氧化應激等都會引起心肌細胞凋亡，從而造成心肌損傷。因此，深入研究AMI的分子機制，尋找減輕心肌缺血損傷、逆轉心肌重構的有效靶點，具有十分重要的意義。

Endophlin A2（EndoA2）是一種突觸頭端接觸蛋白，一般認為與細胞內吞作用有關，廣泛分布于各組織中［4]。最近的研究表明，EndoA2可通過SH3結構域與ClC-3結合，調節ClC-3在胞漿胞膜的分布，進而調控容積調節型氯電流開放，調節血管重構［5]。另外也有研究表明，EndoA2參與調節巨噬細胞泡沫化［6]。本課題組的前期研究也證實，EndoA2通過抑制Bax從胞漿轉位線粒體，減少細胞色素C的釋放，進而抑制過氧化氫誘導的大鼠腦基底動脈平滑肌細胞凋亡［7]。上述研究表明，EndoA2與心血管疾病密切相關。然而，EndoA2是否參與調節AMI后心肌重構過程，至今尚未有報道。本研究采用氧葡萄糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）誘導心肌細胞急性缺血損傷，探討EndoA2對心肌細胞急性缺血損傷的影響，并初步探索PTEN/Akt信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM高糖培養基、DMEM低糖培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibico公司。Ad-EndoA2腺病毒委托上海生博生物醫藥科技有限公司合成并完成滴度測定。EndoA2干擾鏈及轉染試劑購自美國Qiagen公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢凱基公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學發光試劑盒購自碧云天。Caspase-3、PTEN、p-PTEN、PDK1、p-PDK1、Akt、p-Akt購自美國Cell Signaling Technology公司。鼠單抗GAPDH、Ⅱ抗山羊抗兔（IgG）和Ⅱ抗山羊抗小鼠（IgG）購自中杉金橋生物技術有限公司。其他生化試劑均為進口分裝或者國產分析純。

1.2 主要方法

1.2.1 細胞培養及分組H9C2心肌細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃和5%CO2的環境下培養。待細胞融合度達80%以上用0.25%胰酶消化傳代。在各實驗處理結束前12 h進行OGD處理。棄原有培養基，PBS清洗細胞3遍，加入適量DMEM低糖培養基，放置于37 ℃三氣缺氧（N2∶CO2∶O2＝94%∶5%∶1%）培養箱內缺氧12 h。

1.2.2 干擾鏈與腺病毒轉染參照文獻［7] 進行轉染。待細胞融合度為30%～40%，取100μL DMEM高糖培養基稀釋10μL hiperfect，再加入20 nmol/L的干擾鏈。室溫混合10 min，將混合物均勻加入含有1.9 mL培養基的小皿中，放入培養箱中進行培養。6 h后換為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，繼續培養48 h用于后續實驗。

細胞接種于培養皿中，第2天細胞密度約為40%～50%，取100μL無血清無抗生素的培養基稀釋病毒使MOI值適合于實驗，加入含有900μL培養基的培養皿中。6 h后換為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，繼續培養48 h后用于后續實驗。

1.2.3 CCK-8檢測細胞存活率參照CCK-8試劑盒說明書操作，將細胞以每孔104的密度在96孔板中培養24 h，經過不同處理后，加入CCK-8（10μL/孔）于37℃孵育4 h。通過酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度值（OD），并計算細胞存活率，計算公式為：細胞存活率（%）=（處理組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率按照試劑盒說明書操作。細胞懸液在4℃、1 000 r/min離心10 min，棄上清，清洗兩遍后加入1×binding buffer（5× 105～ 5× 106細胞/mL）。分別向混合懸液加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕柔混勻，室溫避光孵育10 min，用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blotting檢測相關蛋白的表達根據參考文獻［8] 檢測PTEN、PDK1、Akt、GAPDH及Caspase-3蛋白的表達情況。簡而言之，PBS清洗細胞后，加入裂解液和蛋白酶抑制劑裂解30 min，然后12 000 r/min離心12 min，取上層清液。采用BCA法進行蛋白定量，并制成蛋白樣品。經SDSPAGE分離蛋白，電轉至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST漂洗2次后，用3%BSA/TBS稀釋Ⅰ抗4℃孵育過夜。第2天TBST漂洗3次后，Ⅱ抗室溫孵育1～2 h，TBST漂洗3次。經ECL顯色液曝光成像，分析條帶。

1.3 統計學方法用GraphPad Prism 5.0統計軟件進行t檢驗或者單因素方差分析（one way ANOVA）。數據均以表示，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 EndoA2提高OGD后心肌細胞的存活率為了探討EndoA2對OGD處理后心肌細胞存活情況的影響，在H9C2心肌細胞上轉染EndoA2 siRNA沉默EndoA2或轉染Ad-EndoA2過表達EndoA2，再OGD處理6 h，CCK-8檢測H9C2心肌細胞存活率。結果顯示，OGD處理后細胞存活率降低，沉默EndoA2細胞存活率進一步降低，而過表達EndoA2細胞存活率明顯升高。與OGD組相比，轉染Ad-lacZ或negative，細胞存活率無明顯變化。見圖1。結果表明EndoA2可提高OGD后心肌細胞的存活率。

2.2 EndoA2抑制OGD誘導的心肌細胞凋亡為了探討EndoA2對心肌細胞凋亡的影響，用流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果顯示單純轉染Ad-EndoA2或siRNA對心肌細胞凋亡無明顯影響。OGD處理后心肌細胞凋亡率明顯增加，沉默EndoA2進一步促進OGD誘導的心肌細胞凋亡，而過表達EndoA2則抑制OGD誘導的心肌細胞凋亡。見圖2。結果表明EndoA2可明顯改善OGD誘導的心肌細胞損傷。

圖1 EndoA2提高OGD后心肌細胞的存活率Fig.1 EndoA2 increased the cell viability of cardiomyocytes after OGD

2.3 Western blot檢測凋亡蛋白Caspase-3的表達為進一步探討EndoA2對心肌細胞凋亡的影響，用Western blotting檢測凋亡蛋白Caspase-3的表達情況。結果顯示，OGD處理后，活化的Caspase-3表達增多，與OGD組相比，沉默EndoA2進一步促進Caspase-3活化，而過表達EndoA2則抑制Caspase-3活化，見圖3。結果進一步證實EndoA2可改善OGD誘導的心肌細胞損傷。

圖2 EndoA2抑制OGD誘導的心肌細胞凋亡Fig.2 EndoA2 inhibited the apoptosis of cardiomyocytes induced by OGD

2.4 EndoA2通過調節PTEN/Akt通路抑制心肌細胞急性缺血損傷為了探討EndoA2抑制心肌細胞急性缺血損傷的分子機制，采用Western blot檢測PTEN/Akt通路相關蛋白的表達。結果顯示，OGD促進PTEN磷酸化，抑制PDK1和Akt磷酸化。沉默EndoA2進一步促進OGD誘導的PTEN磷酸化，抑制PDK1和Akt磷酸化，過表達EndoA2則發揮相反的作用，見圖4。

圖3 EndoA2抑制OGD誘導的Caspase-3活化Fig.3 EndoA2 inhibited the activation of Caspase-3 induced by OGD

圖4 EndoA2對PTEN/Akt通路的影響Fig.4 The effect of EndoA2 on PTEN/Akt signaling pathway

3 討論

AMI是一種嚴重危害人類健康的缺血性心臟病。主要由于冠狀動脈狹窄，導致心肌供血不足，從而出現心肌代謝功能障礙和結構損傷，最終導致心肌重構以及心功能異常［9]。心肌重構是心功能逐步下降導致心衰的重要病理生理學基礎，包括梗死區心肌細胞缺血壞死、室壁纖維化和變薄以及非梗死區膠原沉積［10]。臨床上對于AMI的治療措施主要是一些補救性的治療方法，在減輕心肌損傷，逆轉心肌重構等方面存在明顯的不足。因此，尋找特異性逆轉心肌重構，保護缺血心肌的分子靶點，對改善AMI后心臟預后具有十分重要的意義。

Endophilin是在篩選小鼠胚胎基因cDNA文庫時，因含有一個富集多聚脯氨酸的SH3結構域而被發現［11]。Endophilin由兩個亞型組成，分別是endophilin A和endophilin B。EndoA2作為其中的一個成員，被廣泛報道可以和內吞蛋白結合，影響膜的內陷、裂變到晚期的脫殼，參與網格蛋白介導的內吞過程［12-13]。另外的研究表明，EndoA2的SH3結構域與BPGAP1富集脯氨酸的結構域結合調節表皮生長因子受體的內吞［14]。EndoA2的SH3結構域與單克隆非特異性抑制因子β結合，抑制酵母多糖的吞噬［15]。除了內吞功能，EndoA2的非內吞功能也被廣泛報道。EndoA2可以促進容積調節型氯通道蛋白ClC-3從胞漿向胞膜轉運，進而促進平滑肌細胞增殖，調節血管重構［5]。本課題組的前期研究也證實EndoA2通過抑制Bax從胞漿轉位線粒體，抑制線粒體通路誘導的平滑肌細胞凋亡，調節血管重構［7]。此外，EndoA2還可以調節巨噬細胞泡沫化［6]。以上研究證實，EndoA2對動脈粥樣硬化、血管重構等心血管疾病具有重要的調節作用。那么，EndoA2是否能夠改善心肌急性缺血損傷，進而影響AMI后心肌重構呢？

在本課題中，筆者通過OGD建立心肌細胞急性缺血模型。結果顯示，過表達EndoA2明顯抑制OGD誘導的心肌細胞凋亡，沉默EndoA2則進一步促進OGD誘導的心肌細胞凋亡。EndoA2改善心肌急性缺血損傷的分子機制尚不清楚，值得進一步研究。PI3K是一個調節細胞生長的重要因子，在糖尿病心肌病、缺血/再灌誘導的心肌損傷以及心肌肥大模型中，PI3K/Akt通路被激活［16]。PTEN是調節PI3K活性的負性調節子。研究表明，失活PTEN明顯抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥大［17]。此外，在缺血心肌，TIEG1通過調節PTEN/Akt通路，改善缺血誘導的心肌損傷［18]。以上結果提示PTEN在心血管疾病的病理生理過程中具有重要作用。那么，PTEN在EndoA2改善心肌急性缺血損傷過程中是否發揮調控作用呢？為了解決這個問題，本研究采用Western blotting的方法檢測了PTEN、PDK1以及Akt的表達情況。結果發現，過表達EndoA2抑制PTEN磷酸化，促進PDK1和Akt磷酸化，沉默EndoA2則發揮相反的作用。提示PTEN/Akt通路參與了EndoA2改善心肌急性缺血損傷過程。

綜上所述，本研究發現EndoA2明顯抑制OGD誘導的心肌細胞凋亡，表明EndoA2具有改善心肌細胞急性缺血損傷的作用，其機制可能與PTEN/Akt通路相關。本文通過對EndoA2調節PTEN/Akt通路抗心肌急性缺血損傷的機制研究，為改善AMI后心肌重構提供新的治療策略。